[发明专利]一种短管赤眼蜂DNA酶及其生产方法和应用

说明书

本发明涉及酶技术领域，尤其涉及一种短管赤眼蜂DNA酶及其生产方法和应用。所述短管赤眼蜂DNA酶的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。通过基因技术筛选出高产量表达短管赤眼蜂DNA酶的毕赤氏酵母菌株Pichia‑TPDNase，该菌株能够大批量的生产出短管赤眼蜂DNA酶，生产工艺步骤简单、成本低，且生产出的短管赤眼蜂DNA酶可应用于致病菌核酸检测试剂盒中，具有较好的经济效应，值得推广应用。

技术领域

本发明涉及酶技术领域，尤其涉及一种短管赤眼蜂DNA酶及其生产方法和应用。

背景技术

DNA酶广泛存在于多种哺乳动物、虾类、昆虫和植物中，对于个体的发育、细胞正常的老化凋亡、以及防御系统的构建具有重要的生物学功能。DNA酶是一种多功能核酸内切酶,可以以非特异性的方式切割DNA,作用于两个脱氧核糖核苷酸之间的3',5'-磷酸二酯键，将DNA链切割开并将其降解成单个核苷酸或寡聚核苷酸。其中研究最多的是哺乳动物和人类的DNA酶，例如来源于牛胰腺的DNase I被广泛应用于生物学研究和医学分子检测试剂盒，而来源于人的重组DNaseI还被应用于一些疾病的治疗，例如囊肿性纤维化(cysticfibrosis,CF)、肺不张和复杂性肺炎伴胸腔积液和脓胸等。

在科学研究和分子临床诊断中，DNA酶是一个功能强大的工具,可用于一系列的分子生物学应用,包括:反转录PCR(RT-PCR，包括荧光定量法和传统的凝胶成像法)去除模板中DNA污染造成的假阳性，组织和细胞RNA提取后基因组DNA污染的去除，核酸法检测病毒和致病菌时模板中DNA污染的去除，以及基因表达调控中DNA顺式作用原件的蛋白质特异性结合鉴定等等。

近些年来的研究发现，DNA酶也是昆虫防御系统的重要组成部分，例如对黄蜂毒液的主要成分进行分析，发现包括组胺、五羟色胺、蛋白酶、缓激肽、DNA酶和透明质酸酶等。相对于人和哺乳动物的DNA酶，昆虫的DNA酶相关的研究相对较少，对它们的活性研究以及应用实例也处在相对缺乏的状态。

发明内容

本发明公开了一种全新的短管赤眼蜂DNA酶，将编码短管赤眼蜂全新DNA酶的基因序列进行密码子优化以后，合成并导入毕赤氏酵母表达系统中，通过发酵条件的优化，实现了新DNA酶的高效表达，体外DNA降解实验表明，短管赤眼蜂DNA酶能有效降解双链DNA，其活性与来源于牛胰腺的DNase I相当，并且其活性高度依赖于二价镁离子(Mg²⁺)，加入高于镁离子浓度的螯合剂EDTA后可有效抑制其酶活，具体方案如下：

本发明一方面公开了一种短管赤眼蜂DNA酶，所述短管赤眼蜂DNA酶的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

本发明第二个方面公开了一种生产上述的短管赤眼蜂DNA酶的方法，包括以下步骤：

S1:将短管赤眼蜂基因LOC111693613(Genbank accession number:LOC111693613)进行密码子优化；

S2：将S1得到的核苷酸序列克隆到重组质粒进行基因扩增；

S3：将S2得到的基因片段导入表达载体得到重组表达载体；

S4：将S3中得到的重组表达载体转化入毕赤氏酵母的感受态细胞中；

S5：将S4中转化成功的感受态细胞进行筛选，得到高产量表达短管赤眼蜂DNA酶的毕赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase；

S6：将S5中得到的毕赤氏酵母菌株Pichia-TPDNase进行大规模培养，分离纯化发酵液得到短管赤眼蜂DNA酶。

进一步的，在S2中，将S1得到的核苷酸序列克隆到质粒pUC57的EcoRV位点进行基因扩增。

进一步的，所述S3包括以下步骤：