[发明专利]一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其检测方法和制备方法

权利要求书

1.一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有ZEA抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述检测线和所述质控线的包被量分别为0.1mg/mL和0.2mg/mL。

3.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜搭接。

4.一种权利要求1所述玉米赤霉烯酮定量快速检测卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：制备偶联有ZEA抗体的乳胶微球，并将其冻干包被储存备用；

步骤二：将玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂包被于硝酸纤维素膜以形成检测线，将羊抗鼠抗体包被于硝酸纤维素膜以形成质控线；

步骤三：将所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上。

5.根据权利要求4所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂通过下述方法制备获得：先取2mg玉米赤霉烯酮半抗原溶解于200μL无水吡啶中，再加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于室温条件下震荡反应24小时后，进行真空干燥处理，将真空干燥处理后的残留物溶于100μL的HCl中调至pH为3.0，然后沉淀水相中的反应产物，并用乙酸乙酯萃取5次，收集萃取后的乙酸乙酯，再进行抽真空干燥处理，即得到ZEAO的粗提物；将上述得到ZEAO的粗提物溶于1mL甲醇中，并以体积比乙醚：乙酸乙酯＝3:2为展开剂，对ZEAO的粗提物进行薄层层析展开，再用甲醇洗脱上述展开物中含ZEAO的硅胶，在收集甲醇并抽真空干燥处理后即得到ZEAO；将上述得到的ZEAO取1μmol溶解于100μL的二甲基甲酰胺中，再加入2μmol的NHS和1μmol的EDC，在室温条件下震荡反应12小时，即得到ZEAO的活化产物；取2.7mgc的BSA溶于300μL浓度为0.05mol/L的NaHCO3溶液中，将上述ZEAO活化产物逐滴加到cBSA溶液中，边加边搅拌，并在室温条件下搅拌反应24小时，即得到ZEAO偶联产物；将得到的ZEAO偶联产物用超纯水4℃透析72小时，于-20℃条件下保存备用，即得到所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂。

6.根据权利要求4所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述偶联有ZEA抗体的乳胶微球通过下述方法制备获得：

S1：在乳胶微球中加入25mM、pH6.0的MES缓冲溶液，混匀后利用MES缓冲溶液进行离心洗涤；

S2：以1L乳胶微球对应40μL的NHS和40μL的EDC的比例分别加入25mM的NHS和EDC反应液，混匀后进行孵育10min处理；

S3：利用MES缓冲溶液进行离心洗涤、去上清液处理；

S4：加入ZEA抗体至其终浓度为0.6mg/mL后混匀；反应2h；

S5：进行离心去除上清处理，并加入2％的BSA进行封闭,再次混匀；在反应1h后进行离心去除上清处理，之后，加入2％的BSA进行清洗、混匀；

S6：进行离心去除上清处理，乳胶微球悬浮于储存10mMpH7.0PBS缓冲溶液中，混匀并保存于储存温度为2-8℃的冰箱中备用，即得到偶联抗体；

S7：取上述制得的偶联抗体用冻干稀释液稀释后，进行冻干处理，将偶联抗体冻干于乳胶微球的微孔中形成反应微孔，即完成所述偶联抗体的冻干与包被，得到偶联有ZEA抗体的乳胶微球。

7.根据权利要求6所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述25mM、pH6.0的MES缓冲溶液的的制备方法为：将0.53g的MES溶于90mL纯水中，调节pH为6.0，并用纯水定容于100mL。