[发明专利]一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法

说明书

本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT‑PCR检测方法，先设计针对基因VI型新城疫病毒强毒株F基因的荧光RT‑PCR扩增引物和探针；再提取待测样品核糖核酸(RNA)，用扩增引物和探针进行荧光RT‑PCR反应，根据荧光RT‑PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有基因VI型新城疫病毒强毒株；本发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点，可实现基因VI型新城疫病毒强毒株快速检测，满足疫病早期诊断和疫情监测的需要，便于基层操作和推广应用。

技术领域：

本发明属于动物病原检测技术领域，具体涉及一种基因VI型新 城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法。

背景技术：

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒感染引起的一种禽的急性、高度接触性传 染病。新城疫传播迅速、死亡率高，是严重危害养禽业的重要疾病之 一，已给养禽业造成巨大经济损失。我国农业部将ND列为一类动物 疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病。

新城疫病毒具有多样性，根据新城疫病毒致病性差异，可分为弱 毒株、中等毒力株和强毒株。根据新城疫病毒遗传学特性可分为两大 类(I类和II类)，其中I类新城疫病毒包括10个基因型，均为弱 毒株；II类新城疫病毒包括18个基因型，我国分离到的II类新城疫病毒主要为基因I型、II型、VI型、VII型等，其中基因VI型和 VII型为强毒株。NDV具有较强的宿主特异性，目前，基因VII型是 我国鸡群中流行的优势基因型。1980s后，基因VI型NDV一直在世 界范围内的鸽群中流行和传播，并对鸡表现出一定的感染风险。我国 新城疫主动监测数据表明，鸡群中NDV强毒带毒率呈逐年下降趋势， 而鸽群中新城疫强毒带毒率有上升趋势，提示我们应对鸽群中基因 VI型新城疫强毒株加以关注。因此，建立一种特异性强、敏感性高、 快速有效检测基因VI型新城疫强毒株的检测方法，对于开展疫病的 早期诊断、防止疫情进一步扩散具有重要意义。

目前，我国新城疫防控主要采用弱毒活疫苗免疫，由于活疫苗的 普遍使用和弱毒株的大量存在，给新城疫确诊带来巨大挑战。单纯检 测NDV的血清学(血凝抑制试验)、分子生物学(RT-PCR)技术已无 法满足快速确诊和早期诊断的需求。新城疫确诊需要依靠病毒致病性 评价，传统的新城疫病毒毒力测定方法为生物学试验，即依据鸡胚平 均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉 致病指数(IVPI)来鉴定，以上方法检测周期长，且需要在一定级别 的生物安全实验室内操作，不适合大规模推广应用。常规的RT-PCR 技术结合序列测定也可鉴定病毒毒力，但与荧光RT-PCR技术相比， 该方法所需时间较长，不能满足第一时间确诊的需求。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种 基因VI型新城疫强毒株的荧光RT-PCR检测方法，设计针对基因VI 型新城疫强毒F基因的荧光RT-PCR扩增引物和探针，建立能检测VI 型新城疫强毒的荧光定量RT-PCR方法。

为了实现上述目的，本发明先从待检样本(棉拭子、组织病料或 病毒分离物)中提取病毒基因组RNA，以基因VI型新城疫强毒F基 因为靶基因，通过荧光RT-PCR引物CII-167F、CII-389R和探针 VI-353R对提取的RNA模板进行荧光RT-PCR扩增，并根据扩增曲线和Ct值分析被检样品中是否含有基因VI型新城疫强毒，其具体工艺 步骤如下：