[发明专利]一种植物叶片衰老指数的测定方法

说明书

本发明提供一种植物叶片衰老指数的测定方法。该方法如下：首先提取植物叶片的总RNA，以甲醛‑琼脂糖凝胶电泳法对其进行电泳，凝胶成像系统照相，分析总RNA的提取质量。用紫外可见分光光度计测定其含量和纯度。然后分离纯化mRNA，用紫外可见分光光度计测定其含量和纯度。用mRNA含量/总RNA含量表示叶片衰老指数。该方法灵敏、准确，反映了叶片衰老的本质。

技术领域:本发明涉及一种植物叶片衰老指数的测定方法。

技术背景:植物生长发育过程中，会吸收氧气，产生活性氧和自由基，氧化细胞DNA、RNA、蛋白质和生物膜磷脂，使遗传物质受到破坏，使蛋白质功能下降或丧失功能，使生物膜磷脂的多不饱和脂肪酸的侧链发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化产物(LipidPerOxide, LPO)如丙二醛 (Malonaldehyde, MDA)，使细胞膜的流动性和通透性发生改变,最终导致细胞结构改变和功能下降，导致叶片衰老。植物叶片衰老时，光合功能衰退，严重影响作物的产量和品质。

目前，人们一般以MDA含量作为细胞或组织衰老的指标。然而，MDA它仅反映细胞抗氧化一方面的能力，不能完全反映细胞的生理活性和衰老状况。所以，发明一种植物叶片衰老指数的测定方法对于预防作物叶片衰老，提高农作物产量和品质具有重要意义。

发明内容：

植物体的一切变化都是以蛋白质和核酸的代谢为基础，植物体内的功能物质——蛋白质是由脱氧核糖核酸（DNA）转录成核糖核酸（RNA），然后再由RNA翻译而成的。蛋白质和RNA的合成反映了细胞活力（衰老程度），然而，由于细胞内存在着结构蛋白和储藏蛋白，他们与细胞活力无关，因此，以蛋白质含量作为细胞衰老的指标是不灵敏的。

总RNA 包括rRNA、tRNA、核内小分子RNA和mRNA，rRNA在生物体内稳定性较好，含量较高，能存在较长时间，称为长寿命RNA，它们不能灵敏地随细胞活性的变化而变化，而mRNA在植物体内不能长期存在，发挥功能后很快被RNA酶降解，mRNA含量反映了基因转录活性的高低。mRNA含量较低，只占总RNA 的1-5%，且随细胞的生理状况而变化，故mRNA /总 RNA更能反映细胞基因转录活性的高低。以 mRNA /总 RNA作为叶片衰老的指标具有更高的灵敏性。

总RNA的提取方法。先取100mg样品放入液氮中研磨并匀浆，后加入450ul的胍基硫氢酸缓冲液，并涡旋振荡，使核酸酶变性失活，以得到完整的核酸，把样品液移入QIAshredder旋转柱中，在20℃下以14000rpm离心2分钟，上清液中加入225ul的乙醇，提供硅胶膜束缚核酸的条件，把样品加入到含有硅胶膜的RNeasy mini 旋转柱中，总RNA吸附到硅胶膜上，用缓冲液洗脱去各种污染物。最后用无核糖核酸酶的水把总RNA从RNeasy mini旋转柱中洗脱下来。以甲醛-琼脂糖凝胶电泳法对其进行电泳，凝胶成像系统照相，分析总RNA的提取质量。用紫外可见分光光度计测定其含量和纯度。

mRNA的分离和纯化方法。在250ul的总RNA样品中加入250ul的OBB缓冲液和15ul的oligotex悬浮液并混合均匀，在70℃水浴中温育3分钟，室温下放10分钟，使mRNA的Poly-A与oligotex粒子杂交，然后在20℃下以18000g离心2分钟，以沉淀oligotex-mRNA复合物。用400ul的缓冲溶液OW2重新悬浮oligotex-mRNA并转移到一个小旋转柱中,在20℃下以18000g离心1分钟，重复此步骤一次。最后加缓冲液OEB于小旋转柱中,在20℃下以18000g离心1分钟，把mRNA从oligotex-mRNA中洗脱下来。用紫外可见分光光度计测定其含量和纯度。

叶片衰老指数计算：叶片衰老指数=mRNA含量 /总 RNA含量。