[发明专利]基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo‑B敲除模式小鼠的方法及应用，获得Nogo‑B敲除模式小鼠的方法包括步骤：设计高效的识别特定基因EGE‑ZXH‑007的sgRNA；将sgRNA连入质粒载体上，然后进行体外转录，得到可进行显微注射的Cas9/sgRNA；将可进行显微注射的Cas9/sgRNA显微注射到小鼠受精卵中，然后对出生的小鼠进行基因型检测和鉴定，确认最终得到Nogo‑B敲除模式小鼠。本发明采用CRISPR/Case9技术制备Nogo‑B敲除模式小鼠，与传统基因敲除技术相比，更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变，为进一步研究Nogo‑B的功能打下良好的基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用。

背景技术

基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因同源重组技术是指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3-5天)分离出的内细胞团细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性，在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠子宫，它能发育成胚胎的各种组织。

基因敲除动物模型是在活体动物上开展基因功能研究的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、胚胎干细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除小鼠一般也需要一年以上。

Nogo-B是网状蛋白家族4的重要成员，广泛表达于中枢神经系统及外周组织，其亚细胞定位于细胞内质网及细胞膜，Nogo-B主要参与血管损伤、组织修复、再生及炎症过程的调控，并可能在肿瘤细胞凋亡中也发挥重要作用。因此构建Nogo-B敲除模式小鼠，对于深入研究Nogo-B在多种疾病中的作用机制有重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用，构建方法易于操作，效率高，更容易得到纯合子突变，为进一步研究Nogo-B的功能打下良好的基础。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法，包括步骤：设计高效的识别特定基因EGE-ZXH-007的sgRNA；将sgRNA连入质粒载体上，然后进行体外转录，得到可进行显微注射的Cas9/sgRNA；将可进行显微注射的Cas9/sgRNA显微注射到小鼠受精卵中，然后对出生的小鼠进行基因型检测和鉴定，确认最终得到Nogo-B敲除模式小鼠。

优选地，基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选地，基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，质粒载体为带T7启动子的质粒载体。

优选地，基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，在将sgRNA连入质粒载体上之前，还包括Cas9/sgRNA构建和活性检测的步骤。