[发明专利]一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法

说明书

本发明涉及一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、氯化钾、乳酸钠、氯化钙、葡萄糖、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂，该发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的稳定性、生物相容性、生物稳定性。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法。

背景技术

外泌体（exosome)最早于1983年被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。它作为人体内一类重要的囊泡，由活细胞分泌的一种双层膜状结构的小囊泡，直径约40-150nm, 携带了母细胞重要的信号分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。

目前有多项研究表明，人间充质干细胞源外泌体能够参与皮肤再生过程中的信号传递，具有很强的抗氧化作用，并在多个器官的生理及病理状态下的再生过程的信号分子的协作中起到重要的作用。

专利号为201710262634 .8的专利申请,是关于人间充质干细胞源性生物活性制剂得制备方法及应用的专利申请,其公开了将外泌体生物活性制剂做成冻干粉形式，并溶解于甘油等组成得溶液中，最后得到外泌体的混悬液；将混悬液进行离心处理收集沉淀干燥后得到美容制剂。

但这种方法存在明显的不足：1.外泌体在反复的冷冻干燥过程中会损伤外泌体的囊泡结构降低外泌体的作用活性，从而影响后期的治疗效果；2.这种美容制剂中添加太多其他成分，而这些成分本身不具备治疗效果，会影响或减弱外泌体的治疗作用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术问题中关于生物制剂的保存效果不理想的技术缺陷。

为此，本发明提供了一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；

（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；

（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；

（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠（0.1-2%）、氯化钾（0.1-1%）、乳酸钠（0.1-1%）、氯化钙（0.1-1%）、葡萄糖（0.05-5%）、必须氨基酸（0.01-5%）、非必须氨基酸（0.01-5%）、人血清白蛋白（0.1-10%），即为所制备的外泌体生物制剂。

所述上清液进行超滤法处理,具体包括如下步骤:

a、将收集到的上清液分装于50mL的离心管中，在4℃ ,300g离心10min，除去残余细胞；2000g离心20min，除去细胞碎片；收集上清液并用0.22μm孔径的过滤器进行过滤；

b、将步骤（1）收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器；待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。

所述步骤（3）得到的外泌体悬液，需进行蛋白浓度的检测后，再添加步骤（4）所述的物质。

所述生物制剂的具体制备方法是:

1)将人间充质干细胞利用含10%FBS（GIBCO）的alpha-MEM液体培养基进行悬浮为细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml-2×106/ml；