[发明专利]一种用于眼表损伤修复的细胞植片及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于眼表损伤修复的细胞植片，包括细胞膜片层和纤维蛋白层双层结构，所述细胞膜片层为由5～7层上皮细胞排列构成的厚度为50μm～150μm的膜结构，所述纤维蛋白层为由纤维蛋白胶形成的厚度为200μm～500μm的疏松多孔的膜结构；本发明还公开了一种用于眼表损伤修复的细胞植片的制备方法，包括步骤：一、细胞膜片层的制备；步骤二、纤维蛋白层的制备。本发明有利于角膜上皮层的修复和再生，降低了手术难度，提高了细胞利用率和细胞植片制备效率，提高了细胞植片成活率，实用性强，使用效果好，便于推广使用。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用于眼表损伤修复的细胞植片及其制备方法。

背景技术

角膜从外向内可以分为五层，分别是角膜上皮层、前界层（又称Bowman层，前弹力层）、角膜基质层、后界层（又称Descemet层，后弹力层）和角膜内皮层。其中，角膜上皮层厚50～100μm，由5～6层无角化的复层鳞状上皮细胞构成。细胞排列整齐，易与前弹力层分离。保持角膜上皮层的完整和无血管化状态对于维持角膜的生理功能十分重要。理论上，比较轻微的眼表损伤可以通过角膜缘干细胞（corneal limbal stem cell，CLSC）的增殖、定向移行和分化完成对角膜上皮层的修复。然而，临床上的多种因素，包括机械损伤、化学烧伤、高温烫伤、感染、溃疡和其他角膜疾病，通常都会造成角膜缘干细胞的缺失，致使受损角膜上皮层无法修复，进而出现角膜混浊、新生血管长入、影响正常视力，严重时会导致失明。

治疗眼表疾病最有效的方法是进行角膜移植。但是，异体角膜移植依赖于捐献，受到供体来源的极大限制，无法满足大量的临床需要。而自体的角膜缘移植也受到来源不足的限制，同时也使健眼的安全受到威胁。因此，眼表损伤的治疗仍然是目前较为棘手的问题。

组织工程学和生物材料科学的发展为修复眼表损伤提供了许多新的思路和方法。尝试最多的是使用羊膜（或其他生物膜）覆盖受损眼表，利用羊膜中含有的胶原蛋白、透明质酸和生长因子等活性成分，减轻炎症反应，抑制瘢痕和血管形成，从而保护和修复受损眼表上皮层。更进一步的做法是使用羊膜作为基底膜，通过在其表面负载细胞，构建成组织工程化角膜上皮植片用于治疗眼表损伤。申请号为200410019341.X的中国专利公开了一种“角膜缘干细胞组织工程复合体及其制备方法，它使用脱细胞羊膜作为载体，将角膜缘干细胞接种在其表面形成复合体用于治疗眼表损伤。申请号为200410083822.7的中国专利公开了一种医用角膜贴片及制备方法，它是将自体来源的间充质干细胞接种在处理后的羊膜上形成复合物用于眼表修复。申请号为201110400135.3的中国专利公开了一种培养人角膜缘干细胞植片的方法，是将角膜缘干细胞接种在经钴-60灭菌的冷冻干燥保存的羊膜上，形成细胞植片。以上发明都利用羊膜作为细胞载体，存在着以下问题：（1）经脱细胞、干燥、灭菌等步骤处理的羊膜，其中的生物活性成分流失或破坏，难以发挥预期的作用；（2）羊膜的分子透过性差，移植后羊膜上的细胞难以获得营养和氧气，极易导致细胞死亡；（3）羊膜载体结构致密、降解速度慢，影响细胞和眼表的整合；（4）向羊膜表面接种细胞难度大、细胞流失率高，并且细胞难以形成复层，与天然角膜上皮层结构相差甚远。

申请号为200480003698.7的中国专利公开了一种用于形成角膜上皮的细胞片、及其制造方法和使用方法，它是将形成角膜上皮的细胞接种于温度响应性聚合物包被的培养皿上，根据需要将细胞多层化后，通过温度控制聚合物亲水性能，达到分离细胞片的目的，该细胞片无需羊膜或其他生物膜做载体。然而，该方法构建的细胞片韧性差，从培养皿底分离时仍需要借助PVDF膜做支撑，无法满足临床上复杂的操作要求。

发明内容