[发明专利]一种镍掺杂的有序介孔氧化铝及固定化果糖基转移酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种镍掺杂的有序介孔氧化铝及固定化果糖基转移酶的制备方法，属于生物工程技术领域。所述固定化果糖基转移酶制备方法包括：（1）镍掺杂的有序介孔氧化铝载体的合成；（2）通过铝与氨基酸的配位，将果糖基转移酶固定于载体上；（3）通过镍的激活，提高固定化酶的酶活性。该方法由于制备条件温和，酶与载体间的作用力为配位键，作用力强，酶不容易脱落，同时，由于镍的激活作用，酶能够保持较高的活性，介孔结构的载体，有利于底物快速到达反应位点，实现了果糖基转移酶高活性和牢固的固定化之间的平衡。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种镍掺杂的有序介孔氧化铝体及固定化果糖基转移酶的制备方法。

背景技术

低聚果糖又称为蔗果三糖族低聚糖，是蔗糖分子的果糖残基上通过β1-2-糖苷键连接1-3个果糖基而形成的果糖寡聚糖：蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其它混合物。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，是一种益生元，可促进双歧杆菌的生长、减少有害菌、促进矿物质的吸收、增强身体免疫力、抗癌、降血糖及预防龋齿等作用，并且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、香蕉等植物中，但含量低，开发难度大。

果糖基转移酶能催化蔗糖转化为蔗果低聚糖，但该酶易溶于水，价格昂贵，生产过中从底物中分离困难，只能利用一次，造成生产成本极高，无法实现工业化应用。因此，将果糖基转移酶固载于不溶于水的载体上，使得固定化的酶极易与底物、产物分离，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化，能实现连续反应，便于自动化生产，因此，果糖基转移酶的固定化成为研究的热点。已有报道的固定化载体包括大孔树脂、壳聚糖等高分子材料，羟基磷灰石、磁性氧化铁、活性炭、分子筛、氧化硅等无机材料，这些材料主要通过氢键、离子键、共价键的作用力与酶结合，氢键和离子键由于作用力弱，容易造成酶的脱落，而共价键虽然作用力很强，但是需要载体与酶作用，合成过程中的条件苛刻，容易造成酶失活。各种固定化酶方法有各自的优缺点，如何平衡酶的活性与稳定性，是固定化酶应用需要解决的关键科学问题。因此，设计合成能温和固定化、反应活性高、性质稳定的载体，成为固定化酶工业化应用的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用配位键温和固定化果糖基转移酶的镍掺杂的有序介孔氧化铝的制备方法，解决果糖基转移酶固定化体系中酶的高活性和稳定固定化难以兼得的问题。

为实现上述目的，本发明采用以技术方案：

一种镍掺杂的有序介孔氧化铝的制备方法，包括以下步骤：

1）室温下，将P123（聚乙烯醚-聚丙烯醚-聚乙烯醚嵌段共聚物）溶解在无水乙醇中，得到P123的无水乙醇溶液；

2) 将异丙醇铝和硝酸镍加入到P123的无水乙醇溶液中，加入浓盐酸，充分搅拌溶解后，搅拌5-12h，形成溶胶；

3）将上述溶胶于55-65℃下溶剂挥发自组装45-50h，得到干凝胶，将干凝胶以1.8-2.2℃/min的速率升温至480-500℃，保持3.5-4.5h，即得镍掺杂的有序介孔氧化铝载体。

进一步，所述聚乙烯醚-聚丙烯醚-聚乙烯醚嵌段共聚物、异丙醇铝、硝酸镍的质量比为1∶1-4∶0.01-1，优选为1∶1-4∶0.01-0.25。

采用镍掺杂的有序介孔氧化铝为载体的固定化果糖基转移酶的制备方法：将果糖基转移酶溶解于pH 6-8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中，配制成浓度10mg/mL的酶液，将每10-90mg镍掺杂的有序介孔氧化铝加入10mL水中，超声15-25 min，加入0.1-0.9mL酶液，放入摇床中反应22-26h，弃去上清液，固体颗粒用pH为4.5-6.0的 0.05mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液冲洗2-3次，即得固定化果糖基转移酶。

本发明采用以上技术方案，首先制备镍掺杂的有序介孔氧化铝载体，通过铝与氨基酸的配位，将果糖基转移酶固定于载体上，通过镍的激活，提高固定化果糖基转移酶的酶活性。