[发明专利]一种基于磁性荧光探针标记的荧光免疫吸附测定超痕量高分子纳米药物载体的方法

权利要求书

1.一种基于磁性荧光探针标记的荧光免疫吸附测定超痕量高分子纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、制备PSI_OAm水解溶液；

b、制备PSI_OAm包被抗原和免疫原；

c、抗PSI_OAm 抗体的制备；

d、磁性荧光探针的制备：

d-1、首先将10.8g的FeCl₃·6H₂O和36.5g的油酸钠溶于80mL乙醇中，依次加入60mL去离子水和140mL环己烷，然后于70℃加热4h，待冷却到室温时有机层用去离子水萃取3次，萃取所得溶液混合，在70℃下加热4h蒸发掉环己烷，冷却至室温，即得油酸铁，备用；

d-2、将步骤d-1制备的油酸铁9g加入到50g的十八碳烯中，搅拌均匀后再加入1.4g的油酸，混合溶液加热到100℃保持30min后抽真空，混合物在氮气氛围下加热到320℃保持3h,待反应将到室温时加入20mL的无水乙醇使四氧化三铁纳米晶沉淀，反复洗涤3次后晾干，即得四氧化三铁纳米晶；

d-3、将步骤d-2制备四氧化三铁纳米晶用环己烷溶解，得100mg/mL四氧化三铁纳米晶溶液，将14.4mL环己烷、3.3mLTX-100、0.5mLCO-520、3.3mL正己醇、1.5mL去离子水和0.25mL氨水搅拌混匀，随后加入1mL 100mg/mL的四氧化三铁纳米晶溶液，再加入50μL的硅酸四乙酯搅拌反应2小时，反应完后离心，用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥，即得二氧化硅功能化的四氧化三铁纳米晶，备用；

d-4、称取6.7mg的步骤d-3制备的二氧化硅功能化的四氧化三铁纳米晶分散于50mL的去离子水中，用2M的氢氧化钠调节溶液的pH=9.0，将体系加热到70℃，然后依次加入0.5mL的硅酸四乙酯、0.05mL的罗丹明异硫氰酸酯标记的3-氨丙基三乙氧基硅烷和3mL的乙酸乙酯，避光搅拌10min后，再加入0.05mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌3h，冷却至室温后乙醇洗涤3次，冷冻干燥，即得磁性荧光探针，备用；

e、磁性荧光探针标记的抗PSI_OAm抗体的制备：

e-1、取纯化后的抗PSI_OAm抗体0.4mg加入0.07mL的醋酸缓冲液之后，加入0.14mL的过碘酸钠溶液，室温避光搅拌2h；

e-2、取2mg步骤d-4制备的磁性荧光探针，用PBS洗3次，充分悬浮于0.6mL的PBS中，缓慢加入步骤e-1处理后的氧化后的抗体，4℃下搅拌20h；再加入2mg/mL 0.02mL的硼氢化钠溶液,避光反应2h，用PBS洗涤3次后，即得磁性荧光探针标记的抗PSI_OAm抗体，备用；

f、将PSI_Odm包被抗原经包被液稀释后包被于96孔板中，封闭、加入不同浓度的PSI_OAm标准品，用功能化磁性荧光探针标记抗PSI_OAm抗体，建立直接竞争荧光免疫吸附测定PSI_OAm，具体包括以下步骤：

f-1、包被：用包被缓冲液将PSI_OAm包被抗原稀释至25μg/mL，包被96孔板，每孔100µL，4℃冰箱过夜；

f-2、封闭：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3~5min，洗去未结合的PSI_OAm包被抗原,加入1wt% 酪蛋白，每孔200μL进行封闭，37℃烘箱温育1~2h；

f-3、加样竞争：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3~5min，洗去多余的封闭液,然后将优化后的50µL 磁性荧光探针标记的抗PSI_Odm抗体和50µL不同浓度的PSI_OAm标准品分梯度加入各孔中，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育1~2h；

f-4、检测：PBST溶液洗涤3次，甩干，每次3~5min，除去游离态的PSI_OAm标准品或抗体结合物,用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为530nm，发射波长为585nm处的荧光强度值；

g、以PSI_OAm标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出PSI_OAm的浓度；所述标准曲线的线性方程为F=11477.59-1537.63lgC，其中F为荧光强度值，C为PSI_OAm的浓度，其相关系数R²=0.994，线性范围为5×10^-5-5×10³ng/mL，检出限为3×10^-7ng/mL。