[发明专利]提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种工程菌及其构建方法，具体是一种提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该工程菌经鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌Trx‑TPL(Escherichia coli Trx‑TPL)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年11月13日，保藏编号为CCTCC NO：M2017684。本发明将两个酪氨酸酚裂解酶基因与硫氧还原蛋白基因连接在一起构建表达质粒，可以有效提高表达的酶的稳定性，尤其是热稳定性，可以在提供相关底物下，延长转化合成左旋多巴的时间，增加底物浓度，工艺简单，成本低廉，产率高，具有工业化生产的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其构建方法，具体是一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程领域。

背景技术

左旋多巴(3，4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA)的化学名称为3，4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：

作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。

上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。

酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kDa，是一个四聚体酶。TPL酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，PLP)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-DOPA的产率低。

印度R.KrishnaveniVandanaRathod等人利用真菌Acremoniumrutilum转化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活达1095U/mg。但目前产能较低，只有0.89g/L。

巴基斯坦Ikram-U1-Haq等人对产酪氨酸酶的Aspergillusoryzae进行紫外诱变，诱变株最大产量达1.28g/L。

埃及Doaa A.R.Mahmoud·Magda A.El Bendary利用Egyptian halophilic blackyeast的酪氨酸酶转化生成L-DOPA，产量为66μg/ml。

韩国研究人员使用酪氨酸酶进行转化时，利用电取代还原试剂，将多巴醌(DOPAquinone)还原为L-多巴，使转化率达95.9，生产强度47.27mg/L*h。

也有一些利用自然界中的细菌，如Escherichia、Proteus(变形菌属)、Stizolobiumhassjoo和Erwinia(欧文氏菌属)等，来合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成综述报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/L的L-DOPA。又如，Jang-Young Lee等人克隆来源于Escherichia coli W(ATCC11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶(p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，PHAH)，转化L-酪氨酸为L-DOPA，产物累积至10g/L。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌株，但最终的L-DOPA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的L-DOPA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定性差，副产物多，L-DOPA的产率低。