[发明专利]提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用在审
| 申请号： | 201810455195.7 | 申请日： | 2018-05-14 |
| 公开（公告）号： | CN109439605A | 公开（公告）日： | 2019-03-08 |
| 发明（设计）人： | 储消和;吴黎诚;沈建;生英涛;陈万河;方明山;程跃;赖秧秧 | 申请（专利权）人： | 浙江工业大学;浙江绿创生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/62;C12P13/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州赛科专利代理事务所(普通合伙) 33230 | 代理人： | 施王蓉 |
| 地址： | 310014 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 保藏 工程菌 构建 酪氨酸 裂解酶 大肠 底物 中国典型培养物 应用 基因工程技术 裂解酶基因 表达质粒 还原蛋白 基因连接 热稳定性 转化合成 左旋多巴 产率 硫氧 保存 | ||
1.一种提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌，其特征在于，该工程菌命名为大肠埃希氏菌Trx-TPL(Escherichia coli Trx-TPL)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年11月13日，保藏编号为CCTCC NO：M2017684。
2.根据权利要求1所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法为：将酪氨酸酚裂解酶基因连入硫氧还原蛋白基因，以pET32a为载体，构建质粒pTrx-TPL。
3.根据权利要求2所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌的构建方法，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶基因为全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因。
4.根据权利要求2所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌的构建方法，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶基因来源于弗氏柠檬酸杆菌。
5.根据权利要求2所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌的构建方法，其特征在于，受体菌采用大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求5所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌的构建方法，其特征在于，构建方法具体包括：(1)将克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段连入载体pET32a硫氧还原蛋白基因，并将整合后的重整质粒转化进入BL21(DE3)，获得Trx-TPL菌。
7.一种权利要求6所述提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌用于在底物溶液存在条件下，转化产生L-多巴，其特征在于，
具体操作步骤包括：
(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加氨苄青霉素100mg/L，30-37℃，220rpm，培养12-16h，得到一级种子；
(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30-37℃，200-250rpm，培养2-5h，加IPTG至终浓度0.6mM，28-32℃，180-220rpm，培养10-12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；
(3)离心收菌，得到菌体；
(4)菌体35g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14-16g/L的丙酮酸钠、10-12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5g/L的亚硫酸钠、1-3g/L的EDTA，调pH7.5-8.5。
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