[发明专利]一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用

说明书

本发明公开了一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。本发明提供的蛋白，命名为KfGH01。该酶的原始氨基酸序列如SEQNO：1所示。本发明还涉及表达编码基因的宿主细胞及其诱导培养条件。本发明的实验证明，其具有高效转化三七皂苷Fc并专一生成越南人参皂苷R7的作用，因此具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。

背景技术

五加科人参属植物(如人参Panax ginseng、三七Panax notoginseng、西洋参Panax quinquefolius、越南人参Panax vietnamensis等、竹节参Panax japonicus)具有极高的医药价值和悠久的临床应用历史。人参属植物含有多种不同结构类型的化学成分，如皂苷、黄酮、挥发油、氨基酸、多糖等。研究表明，其所含三萜皂苷类化学成分，是预防和治疗心脑血管、免疫和神经等系统疾病的主要药效物质基础(Chem.Rev.2012，112：3329-3355；J.Pharm.Pharmacol.2006，58：1007-1019)。人参属植物所含皂苷大部分具有相似的母核结构，主要可分为达玛烷型和齐墩果烷型；根据母核C-6位是否具有羟基取代，达玛烷型又可分为原人参二醇(PPD)型和原人参三醇(PPT)型。这些皂苷差别主要存在于其苷元所连糖基的位置、个数或种类不同。最早发现于越南人参根茎当中的越南人参皂苷R7属于PPD型皂苷，其结构式如附图1所示。

鉴于该化合物的分离制备较为困难，一定程度上导致了与其相关的药理活性研究相对空白，目前仅限于本课题组所报道的其具有显著抑制神经炎症中下游代谢产物(如LPS及TNF-α联合诱导因子)的生产和影响多种炎症基因的表达等作用，在研发与神经炎症相关的中枢神经系统疾病药物方面具有一定的潜力(中国中药杂志，2016，41：1498-1503)。

酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。采用绿色酶制剂等生物催化方法，通过糖苷水解酶从含有多糖基侧链皂苷的主体结构中选择性水解掉糖残基，定向制备专一人参或三七皂苷及其类似物的研究报道逐年增多。此外，随着基因工程和蛋白质工程技术的飞速发展，越来越多的相关技术不断应用于生物催化剂-蛋白酶的结构和功能的改造研究当中，其已成为设计和开发新型生物催化剂的重要方法和有效手段。有关糖苷水解酶的定向进化报道较多，主要集中在酶的活力、热稳定性及性质改变等方面。通过定向进化方法提高具有转化人参或三七皂苷功能的糖苷水解酶活性，将十分有助于实现特定皂苷化合物的制备。目前，酶法转化对象大多是集中于连有四个或以下糖基单元的人参皂苷，暂未发现含有四个以上糖单位的人参皂苷或三七皂苷的生物转化报道，且产物也以单糖或二糖苷为主，如Rg3、Rh2、PPD、PPT、Rh1和C-K等(Process Biochem.2014，49：813-820；Appl.Microbiol.Biotechnol.2012，94：377-84)。五糖基达玛烷型三七皂苷Fc在三七茎叶中含量相对较高(1.0-1.5％)，其C-20位为-Glc¹-⁶Xyl连接，仅比越南人参皂苷R7多一个外侧连接的木糖，因此是酶法制备越南人参皂苷R7理想的候选底物。到目前为止，未见有任何三七皂苷Fc糖苷水解酶及其在制备越南人参皂苷R7的报道。

发明内容

针对现有不足，本发明的目的是公开一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。

本发明的蛋白并名为KfGH01，其为如下的蛋白：

(1)氨基酸序列如SEQ NO：2所示。