[发明专利]产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及产聚γ‑谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。本发明公开的产聚γ‑谷氨酸的微生物为过表达磷脂酶C的微生物，所述过表达为引入一个或多个拷贝的磷脂酶C编码基因和/或将磷脂酶C的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。本发明通过提高磷酯酶C的表达获得的微生物，其发酵生产聚γ‑谷氨酸产量得到显著提高。本发明为提高微生物发酵生产聚γ‑谷氨酸的产量、降低生产成本提供了新的策略。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。

背景技术

聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一类天然的阴离子型生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成。γ-PGA分子上带有大量游离的带负电荷的羧基，使其具有与大量金属阳离子结合的能力和亲水的性能。这些结构特点使得γ-PGA具备良好的水溶性、较强的吸附能力、可生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在医药、食品、化妆品、环境保护及农业等领域具有广泛的应用。

作为γ-PGA的合成前体的L-谷氨酸的来源主要有两种，一种是是通过外源培养基的添加；另一种则是通过微生物细胞代谢途径中的三羧酸循环(TCA)的重要中间产物α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶催化生成。γ-PGA合成的另一个前体D-谷氨酸则通过L-谷氨酸经谷氨酸异构(消旋酶)消旋而来。目前，提高菌株γ-PGA产量的研究报道一般集中在针对合成、分解途径的改造和优化。细胞代谢产物的膜转运过程是代谢产物胞外积累的关键步骤，胞内合成的代谢产物需要被高效地转运到胞外，以便于产物的分离提取，同时避免胞内产物大量积累导致的代谢抑制。然而，目前尚没有对于γ-PGA的跨膜转运过程的研究及其在促进γ-PGA高效合成方面的应用。

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中，能专一性水解磷脂甘油sn-3位上甘油磷酸酯键的脂类水解酶。PLC作用底物为甘油磷脂和鞘磷脂两大类，其中甘油磷脂又包括磷脂胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸等。磷脂特别是磷脂酰胆碱和鞘磷脂是生物膜的重要组成部分，PLC通过催化细胞的膜磷脂的水解影响细胞膜的通透性、细胞代谢和信息传递。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供产聚γ-谷氨酸的微生物及其构建方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供产聚γ-谷氨酸的微生物，所述微生物为过表达磷脂酶C的微生物，所述过表达为引入一个或多个拷贝的磷脂酶C编码基因和/或将磷脂酶C的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。

所述磷脂酶C具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失、或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

具体地，所述磷脂酶C为由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码或由具有特异性序列且能够表达与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同功能蛋白的核苷酸序列编码。

所述磷脂酶C来源于细菌，优选来源于芽胞杆菌属细菌，更优选来源于苏云金芽胞杆菌。

所用术语“产聚γ-谷氨酸的微生物”指能够通过发酵产生聚γ-谷氨酸的微生物。本领域技术人员应当理解，产生聚γ-谷氨酸的微生物包括但不限于通过基因工程构建的菌株、通过诱变筛选获得的菌株，通过自然环境直接分离获得的菌株，或是结合以上两种或以上方式获得的微生物。所述微生物包括但不限于芽胞杆菌属的细菌，优选为地衣芽胞杆菌。

进一步地，本发明还提供了产聚γ-谷氨酸的微生物的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建plC基因表达盒，所述表达盒包括启动子、plC基因和终止子；

(2)将plC基因表达盒连接至载体，构建含有plC基因表达盒的载体；