[发明专利]一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。所述复合PCR分型试剂盒包括：PCR试管、PCR混合酶、5对特异性引物、阳性对照、阴性对照和ddH₂O，所述5对特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。所述复合PCR分型试剂盒用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型具有很高的准确性，特异性好，灵敏度达pg级；进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织，可以直接将组织洗涤液或单菌落、菌液经沸水裂解后作为模板，省去了细菌基因组提取的繁琐，大大节约了时间、人力和成本。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型 的复合PCR分型试剂盒及其应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是引起猪呼吸系统的一种严重的接触性传染病，以急性出血性纤维素 性胸膜肺炎和慢性纤维素坏死性胸膜肺炎为特性，广泛存在于世界上养猪地区，特别是养猪 业发达的国家和地区，给养猪业造成巨大的经济损失。

猪传染性胸膜肺炎可感染各年龄阶段的猪只，以6周-6月龄的猪较为多发；且具有较 明显的季节性，多在4月～5月和9月～11月发生。病猪和带菌猪是本病的主要传染源，多呈 继发或并发其他疾病，导致临床症状加重、死亡率升高。自1957年首次报道以来，随着国家与国家之间的频繁引种，猪传染性胸膜肺炎逐渐扩散开来，造成世界范围内的广泛流行。我国八十年代开始有该病的报道，九十年代在广东、青岛等地区爆发流行，造成了巨大的经济损失。近年来，随着集约化猪场的快速发展，猪传染性胸膜肺炎感染发病率也日益增高，已经在我国大部分地区流行开来，并有愈发愈烈的趋势。

猪传染性胸膜肺炎的主要病原为胸膜肺炎放线杆菌(APP)。加膜多糖和菌体脂多糖不同， 可分为15血清型。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性可把15血清型分为两个生物 型。生长依赖NAD的菌株为生物Ⅰ型，包括血清型1～12型和15型；生长不依赖NAD的菌株为 生物Ⅱ型，包括血清型13和14。其中血清型1和5型又可分为a和b两个亚型。此外，还有一些 根据现有分型方法不能定型的血清型。

不同血清型间的致病力不完全相同，普遍认为，生物I型APP的致病性要强于生物II型， 而且各血清型间交叉保护力比较弱。APP在不同国家的分别存在差异，各国的优势血清型也 不相同。随着不同国家及地区之间猪只的流通加剧，APP也变得日益复杂，同一地区，甚至 同一猪场存在多个血清型同时存在的状况。在中国，目前已发现并分离到血清型有1、2、3、 4、5、7、8和15等，主要流行血清型有1、3、5和7型。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分型方法主要分为血清学方法和基因分型方法。血清学分型方法 主要有补体结合、间接血凝、乳胶凝集、琼脂扩散、ELISA。但因为操作繁琐、周期长、或 敏感性低、特异性差等不能满足临床的需求。而且目前猪场多为混合感染，因此迫切希望一 种高度特异、敏感和简便的方法来高通量、快速分型方法。基因分型方法主要为PCR分型方 法，复合PCR技术以其特异、快速、敏感、适于大量样品检测等优点，成为当今细菌病检测 和诊断中最具应用价值的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清 型的复合PCR分型试剂盒及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线 杆菌血清型的PCR引物对，包括5对特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。

一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线 杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，包括：PCR试管、PCR混合酶、5对特异性引物、阳性 对照、阴性对照和ddH₂O。