[发明专利]猕猴ROSA26基因及其基因修饰的方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种猕猴ROSA26基因，其包括SEQ ID NO 4中1‑428位DNA序列。本发明还包括在LLC‑MK2细胞系中对猕猴ROSA26基因进行基因修饰的方法，以及利用该体系构建ROSA26位点基因敲入猕猴模型应用于解决常规转基因修饰可能造成的相关问题。本发明为制备外源基因稳定表达、表型一致的猕猴模型提供新的方法和手段，为相关猕猴疾病模型的建立奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鉴定和克隆猕猴ROSA26基因以及在LLC-MK2细胞系中对猕猴ROSA26基因进行基因修饰的方法，还包括利用该体系构建ROSA26位点基因敲入猕猴模型应用于解决常规转基因修饰可能造成的相关问题。

背景技术

1、灵长类作为动物模型的重要性

人类疾病的发生十分复杂，以人作为实验对象来深入研究疾病发生的分子机制以期推动临床研究的发展非常之缓慢。一方面，临床经验的积累不仅在时间和空间上有着巨大的局限性；另一方面，以人作为实验对象在伦理道德和方法上也受到很大限制。借助动物模型的间接研究，可以有意识地改变在自然条件下不可能或不易排除的因素，从而更准确地观察模型的实验结果并与人类相应疾病进行比较研究，进而有利于深入研究人类疾病的发生发展规律，推动疾病治疗措施研发，新药开发等方面的发展。长久以来，由于小鼠的成本较低、生殖繁育周期较短、基因修饰技术更容易实现，小鼠作为动物模型广泛用于各大疾病的研究中，如老年痴呆症、帕金森综合征、动脉粥样硬化、乙型和丙型肝炎、癌症等。然而，小鼠的个体大小、寿命等与人相差甚远，不利于对小鼠模型进行长期研究；在药物代谢，毒理研究等方面小鼠与人同样差异很大；很多小鼠模型并不能准确模拟人的相应病症；这些方面极大地限制了小鼠作为模型向临床前研究转化的价值。因此，构建与人大小相仿、寿命较长、遗传物质、解剖结构、病理生理学反应等与人更接近的大型动物模型近年来得到了长足的发展。例如：大型动物猪，它在个体大小、遗传物质、代谢特征、解剖结构、病理生理学反应等多方面与人非常相似。此外，猪的自然寿命较长(10-15年)，可以用于长期观察和研究，从而更好的模拟疾病在不同阶段的病理特征，包括观察病症的发生与消退，药物治疗的药理反应，效果，毒性等。因此，大型动物猪模型构建近年来慢慢兴起。然而，非人灵长类猴和其它大型动物(猪、羊、牛等)相比，与人更接近，比如：非人灵长类猴子和人有着相似的寿命、生理代谢、解剖结构、代谢特征和人非常类似。因此，猴子模型比其它动物模型可以更好的观察人类疾病发生、病情进展和检测评价试验药物效果。猴子模型是一项非常宝贵的资源，对猴子进行基因修饰研究是一项具有非常重要意义的课题。

2、基因打靶(Gene targeting)和基因修饰(Gene editing)技术应用于动物模型构建

基因打靶和基因修饰技术已经广泛应用于各种动物模型构建(如斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猪、猴)。基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究该基因的功能。Smithies等最先报道了人的β-globin位点基因打靶。1981年，Martin和Evans等同时报道了从小鼠囊胚的内细胞团中可分离出小鼠的胚胎干细胞(ESCs)，之后基因打靶技术和小鼠ESCs结合起来迅速广泛应用于小鼠模型构建中。Thomas和Doetschman等首次报道了在小鼠ESCs中对次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)基因位点的成功打靶。在家畜动物中(猪、牛)，虽然胚胎来源的多能细胞系已有报道，但是利用该细胞系尚未成功获得嵌合体的子代，因此这也限制了家畜动物利用ESCs进行基因打靶的发展。而猴和人的ESCs已经有了成功的报道，利用ESCs进行基因打靶已经有了相应的研究，这将为基因打靶技术广泛应用于基因功能研究、构建非人灵长类疾病动物模型的研制打下了深厚的基础。