[发明专利]水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法

说明书

本发明公开了一种水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：1)称取水产品肌肉样品，加入Mcllvaine缓冲溶液，旋涡混合，再加入无水硫酸钠和氯化钠，提取溶剂3%甲酸的乙腈，旋涡混合并离心，取上清液，重复提取合并上清液；2)提取液中加入C18粉净化，漩涡并离心，取上清氮气吹干，复溶后过滤；3)滤液进行UPLC定量测定，采用外标法计算多西环素及代谢产物4‑差向多西环素、6‑差向多西环素的残留量。本方法处理样品简便快速，同时优选了提取溶剂、净化剂和液相色谱流动相，可同时测定水产品中多西环素及代谢产物，重复性好、准确度高。

技术领域

本发明属于水产品质量安全领域，具体涉及水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法。

背景技术

多西环素主要治疗鱼虾类由弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等引起的细菌性疾病。由于不规范使用造成了多西环素在动物中的残留，从而危害人类健康。研究表明，四环素类抗生素用后对肝、肾有损害，因为四环素类要经肝脏浓缩，排入胆汁，进入肠道后再吸收，而排出时主要以四环素类原形经肾小球滤过排出，在尿液内浓度较高，故对肝、肾刺激性较大。临床上肝脏与肾脏功能较差时，特别对妊娠母畜，更易损害肝、肾功能，临床上呈现肝、肾功能障碍的症状。四环素类药物大多数的直接毒性作用是由其药物刺激性，蛋白合成抑制以及骨趋向性引起。使用不当或滥用，往往会加重或加速毒性反应的发生，马属动物静脉注射可导致心律不齐、虚脱，严重者可致死。四环素类药物抗菌谱广，进入肠道后敏感菌受到抑制，不敏感或耐药菌如真菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌，魏氏梭菌趁机繁衍，致使肠道菌群紊乱，产生新的感染菌源。

近些年来，多西环素的残留检测技术不断发展，主要方法有酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法等。目前这些检测方法中使用的提取方法大部分采用Mcllvaine缓冲溶液提取，过HLB小柱，之后淋洗洗脱的提取方法。此方法中采用的提取液量大，过柱时间长，而且HLB小柱的成本非常高。另外多西环素(DOX)与其代谢产物4-差向多西环素(4-EPI)和6-差向多西环素(6-EPI)，为差向异构体，分子量完全相同，很难完全分离。为了缩短处理时间和经费成本，本发明采用简便快速的分散固相萃取方法，提供了一整套样品处理方法。为了使DOX与4-EPI和6EPI完全分离，本方法采用了超高效液相色谱，粒径低的色谱柱，优化流动相，使三者完全分离。本方法中样品量大约是以前方法的二分之一，提取时间大大减少，成本约是原来的十分之一。而且方法中优化选取了最佳的流动相，达到了良好的分离度，得到了良好的精密度和准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，采用简便快速的分散固相萃取方法提取样品，选取了最佳的流动相和检测条件，检测结果精密度和准确度良好。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：

水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法，其步骤是：

1)提取：称取水产品肌肉样品，加入Mcllvaine缓冲溶液，旋涡混合；再加入无水硫酸钠和氯化钠，提取溶剂3％甲酸的乙腈，进行漩涡，离心后取上清液；然后采用相同体积的提取溶剂再提取一遍，合并上清液；

2)净化：在上清液加入分散固相萃取试剂C18粉，漩涡后离心，取上清氮气吹干，再加入体积比为1:9的甲醇和0.1％甲酸水的混合液进行复溶，经0.22μm的有机滤膜过滤，滤液供UPLC检测；

3)UPLC测定：液相色谱流动相的水相为5mmol/L乙酸铵水溶液含0.1％甲酸(v/v)，有机相为甲醇及乙腈(3:1，v/v)的混合液，含5mmol/L乙酸铵和0.1％(v/v)甲酸；待测样品的混合标准品上机测定，绘制标准工作曲线，采用外标法计算水产品中多西环素及其代谢产物4-差向多西环素、6-差向多西环素的浓度。