[发明专利]一种检测黑猩猩腺病毒AdC68的双抗体夹心酶联免疫法

说明书

一种检测黑猩猩腺病毒AdC68的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析技术领域。本发明以纯化兔抗AdC68抗体为包被抗体，纯化重组ADC68GFP为标准品，HRP酶标记的山羊抗腺病毒HEXON抗体为酶标抗体，含2%羊血清的PBST为样品稀释液，以双抗体夹心法检测黑猩猩腺病毒AdC68抗原、病毒蛋白、滴度、病毒颗粒等。该方法具有很高的特异性、灵敏度和精密度，与常用的紫外法测病毒颗粒和蚀斑法测病毒滴度相比，其适用性更广，适合在重组黑猩猩腺病毒纯化工艺过程中的在线检测。通过该方法能够在AdC68制备过程中快速估算病毒量，以指导上游病毒培养和下游纯化工艺。

技术领域

一种检测黑猩猩腺病毒AdC68的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

由于腺病毒具有宿主范围广、高转基因表达能力的特点，目前有高达300种人用治疗或者预防性重组腺病毒药物正用于临床试验，广泛应用的腺病毒载体是人血清型腺病毒AdHu2和AdHu5型。但由于人群中普遍存在针对常见的人血清型腺病毒的中和抗体，削弱了相应腺病毒载体诱导的免疫反应，阻碍了这些载体在临床上的应用。为避免人群中预存抗体对腺病毒载体疫苗免疫或治疗作用的影响，一批从其他种群来源的型别被越来越多的应用于人类疫苗的研究中，其中就有黑猩猩腺病毒载体AdC68。

黑猩猩腺病毒与其他腺病毒一样，都是先在HEK293细胞或者PER.C6细胞中培养，经过破碎细胞释放病毒和纯化步骤，获得纯化的病毒。本发明采用双抗体ELISA法，建立起快速估算黑猩猩腺病毒AdC68的方法。该方法有很高的特异性、灵敏度和精密度，与常用的紫外法测病毒颗粒和蚀斑法测病毒滴度相比，其适用性更广，能够测定抗原、滴度、病毒颗粒、蛋白含量等，适合在重组黑猩猩腺病毒纯化工艺过程中的在线检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测黑猩猩腺病毒AdC68的Elisa方法，用于该型腺病毒培养过程中的在线检测。

本发明以经一定稀释后的纯化重组AdC68GFP为标准品，用Lorry法测定该纯化重组病毒蛋白浓度，标准品蛋白浓度为38.8ug/ml,残留HEK293蛋白含量低于0.3ug/ml其制备方法如下：

（1）将非复制型黑猩猩腺病毒68型病毒以MOI1~10的比例，接种静置培养的HEK293单层细胞，待细胞完全病变后，收获病变的细胞。冻融三次后，剧烈震荡裂解细胞释放病毒；

（2）再经过两次不连续氯化铯密度梯度超速离心获得纯化病毒，纯化病毒再通过脱盐柱处理后，用含10%甘油的PBS保存于-70℃超低温冰箱中备用。

本发明以纯化过的兔抗AdC68抗体为包被抗体，其制备方法如下：以纯化重组AdC68GFP病毒接种家兔，采集免疫家兔血清，测定中和滴度，取不低于中和滴度/1280的抗血清经硫酸铵沉淀粗纯，再经Protein G粗纯，获得纯化抗体。

本发明中酶标抗体为HRP酶标记的山羊抗腺病毒HEXON抗体（购自Invitrogen），含2%羊血清的PBST为样品稀释液，通过双抗体夹心酶联免疫法测定腺病毒。具体实验步骤为：

（1）包被抗体：纯化抗体用包被缓冲液（碳酸钠溶液）稀释，最佳包被浓度为1：50，每孔100ul，4℃过夜；

（2）封闭：洗涤后，用PBST（含0.1%吐温20的PBS）配制2% BSA，每孔200ul，37℃封闭2h；

（3）捕获抗原：标准参考品和待测定样品用含2%羊血清PBST稀释，加样量为100ul，37℃孵育1hr；

（4）加入酶标抗体：洗涤后，加HRP标记的羊抗腺病毒HEXON（购自Invitrogen），使用浓度为1：500，每孔100ul，37℃孵育1hr；

（5）显色：洗涤后，用含0.01%TMB的显色液100ul，室温避光显色30min。