[发明专利]一种检测黑猩猩腺病毒AdC68的双抗体夹心酶联免疫法在审
| 申请号： | 201810364446.0 | 申请日： | 2018-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN108828210A | 公开（公告）日： | 2018-11-16 |
| 发明（设计）人： | 王宁;吴冠军;石慧颖 | 申请（专利权）人： | 天津津斯特生物技术有限责任公司 |
| 主分类号： | G01N33/535 | 分类号： | G01N33/535;G01N33/569 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 300300 天津市东*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 黑猩猩腺病毒 双抗体夹心酶联免疫法 病毒颗粒 种检测 抗体 免疫分析技术 双抗体夹心法 样品稀释液 包被抗体 病毒蛋白 病毒滴度 病毒培养 工艺过程 酶标抗体 在线检测 制备过程 标准品 病毒量 灵敏度 酶标记 腺病毒 紫外法 血清 抗原 斑法 滴度 兔抗 山羊 估算 上游 检测 | ||
1.一种检测黑猩猩腺病毒AdC68的双抗体夹心酶联免疫法，其主要步骤特征为：
（1）包被抗体：纯化抗体用包被缓冲液（碳酸钠溶液）稀释，最佳包被浓度为1：50，每孔100ul，4℃过夜；
（2）封闭：洗涤后，用PBST（含0.1%吐温20的PBS）配制2% BSA，每孔200ul，37℃封闭2hr；
（3）捕获抗原：标准参考品和待测定样品用含2%羊血清PBST稀释，加样量为100ul，37℃孵育1hr；
（3）加入酶标抗体：洗涤后，加HRP标记的羊抗腺病毒HEXON（购自Invitrogen），使用浓度为1：500，每孔100ul，37℃孵育1hr；
（4）显色：洗涤后，用含0.01%TMB的显色液100ul，室温避光显色30min；
（5）读数:加每孔50ul 2M H2SO4溶液终止，450/630nm 波长测定吸收值。
2.如权利要求1所述，标准参考品是经纯化处理过的非复制型黑猩猩腺病毒68型（AdC68GFP），制备为如下步骤：
（1）将非复制型黑猩猩腺病毒68型病毒以MOI1~10的比例，接种静置培养的HEK293单层细胞，待细胞完全病变后，收获病变的细胞；
（2）冻融三次后，剧烈震荡裂解细胞释放病毒；
（3）再经过两次不连续氯化铯密度梯度超速离心获得纯化病毒，纯化病毒再通过脱盐柱处理后，用含10%甘油的PBS保存于-70℃超低温冰箱中备用。
3.如权利要求1所述，包被抗体是经纯化过的兔抗AdC68抗体，制备方法如下：以权利要求2中纯化病毒接种家兔，采集免疫家兔血清，测定中和滴度，取不低于中和滴度/1280的抗血清经硫酸铵沉淀粗纯，再经Protein G粗纯，获得纯化抗体。
4.如权利要求1所述，标准参考品的稀释度为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640，对应浓度为7.76ug/ml、3.88ug/ml、1.94 ug/ml、0.97 ug/ml、0.48 ug/ml、0.24 ug/ml、0.12 ug/ml、0.06 ug/ml。
5.如权利要求2所述，用Lorry法测定纯化重组病毒蛋白浓度，标准品蛋白浓度为38.8ug/ml,残留HEK293蛋白含量低于0.3ug/ml。
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