[发明专利]一种利用微生物合成对羟基苯甲醛的方法

说明书

本发明公开了一种利用微生物合成对羟基苯甲醛的方法，以土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲醛。与化学合成法相比，本发明整个反应过程是在常温常压下进行的，污染小、能耗小，并且制备方法简单，不需要酚类物质作为原料，目标产物的纯度大于98％。

技术领域

本发明涉及一种利用微生物合成对羟基苯甲醛的方法。

背景技术

对羟基苯甲醛(p-Hydroxybenzaldehyde)是一种重要的中间体类物质，广泛地用于医药、香料、农药和石油化工等领域。医药方面，对羟基苯甲醛可用于合成羟氨苄青霉素(阿莫西林)、抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶(TMP)、心脑血管药物艾思洛儿、对羟基甘氨酸和人造天麻等药物；香料方面，对羟基苯甲醛可用于合成香兰素、洋茉莉醛、大茴香醛、丁香醛和复盆子酮等许多名贵香料；农药方面，对羟基苯甲醛可用于合成高效除草剂溴苯腈和羟敌草腈；此外，对羟基苯甲醛还可用于生产杀菌剂、食品饲料添加剂、镀镍光泽剂、以及液晶材料前体的合成。

目前，对羟基苯甲醛的工业生产主要是以邻羟基苯甲醇、邻羟基苯甲酸、苯酚、邻甲酚为原料来进行合成，主要存在以下问题：成本较高、收率偏低、环境污染严重等。

发明内容

本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种利用微生物合成对羟基苯甲醛的方法。本发明以土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲醛。该微生物合成法可以在常温常压下进行、并且具有绿色高效等优点。

本发明利用微生物合成对羟基苯甲醛的方法，包括如下步骤：

步骤1：Gongronella sp.w5发酵液的制备

1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一小菌块(1cm×1cm)接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；

1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块(1cm×1cm)转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；

1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％(V/V)的比例接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；

步骤2：Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备

将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；

步骤3：粗提物的分离

将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分2；

步骤4：组分2的分离纯化

将步骤3获得的组分2过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲醛(w5-2)。

步骤1中，所述固体CPDA培养基以1L计组成如下：200g土豆滤出液(200g土豆加400mL蒸馏水煮沸30min，过滤)、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B₁以及15g琼脂粉混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。

步骤1中，所述Ⅵ液体培养基以1L计组成如下：15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。