[发明专利]蒙脱石封闭活性炭的制备方法、所述方法得到的产品及其应用

说明书

本发明的目的是提供一种蒙脱石封闭活性炭的制备方法，包括颗粒活性炭的处理；以蒙脱石和去离子水制备蒙脱石封闭剂；以封闭剂封闭颗粒活性炭，得到蒙脱石封闭活性炭。本发明蒙脱石封闭活性炭能有效消减检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，但不会吸附细菌而影响后续检测，可应用于多种检测方法中，以提供活菌检测效率和灵敏度。

【技术领域】

本发明属于生物检测领域，具体涉及利用蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)对食品样品直接前处理精制，将EMA(ethidiumbromide monoazide)结合实时荧光环介导等温扩增技术(Rti-LAMP)实现快速特异性检测食品中E.coli O157:H7等食源性致病菌活菌。

【背景技术】

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌中最常见的血清型，也是其多种血清型中最主要的致病菌株，感染剂量低于5CFU。感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorhabic colitis,HC)，还可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等严重并发症，致死率达5％～10％。

目前检测E.coli O157:H7的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子生物学检测。这些方法在不同的检测要求下都有各自的优点，但是也都存在着一定的不足，比如耗费时间长、操作过程繁琐以及检测灵敏度低等。环介导等温扩增技术自2000年日本科学家Notomi发明报道以来，因其可在等温条件下数十分钟内完成核酸的高倍扩增，从而成为继PCR技术之后又一新型更快速、简便的分子生物学检测技术。目前各国研究人员在此基础上发展出了多种病原菌的LAMP检测方法。与PCR等其他方法相比，LAMP有着其独特的优点，如在等温条件下即可完成扩增反应、反应时间短(40-60min)、灵敏度比较高、而且反应温度比较低(60-65℃)，甚至可肉眼直接判断反应结果。

然而这种基于核酸扩增的分子生物检测方法不能区分活、死细胞，因而无法准确定量检测样品中活菌浓度。叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide，EMA)能够穿透破损的细胞壁或细胞膜与DNA共价结合形成耦合物，使其不能发生扩增反应。本发明将EMA结合Rti-LAMP实现快速定量检测活的E.coli O157:H7。

研究表明食品中存在多种水溶性DNA聚合酶抑制剂，会干扰PCR等分子生物学方法检测食品中致病菌。活性炭是一种具有较大表面积、复杂孔隙结构的物质，具有良好的吸附性能，可以用来消减干扰PCR聚合酶活性的抑制剂。但由于活性炭同时能吸附细菌，需要对其表面进行适当封闭，从而防止细菌被吸附。本发明使用蒙脱石封闭的活性炭可以消减食品中水溶性抑制剂，同时不影响食品中细菌的回收。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种消除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂的方法，使检测样品在后续作进一步检测时能够提高活菌含量检测精度。

为了实现上述目的，本发明提供一种蒙脱石封闭活性炭的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)颗粒活性炭的处理：取粒径为0.5-3mm的颗粒活性炭，用水清洗至流出的水无色清亮，在55℃下烘干备用；

(2)蒙脱石封闭剂的制备：按以g/mL计取1份蒙脱石和50份去离子水，混合后高速匀浆，然后以700rpm离心1min，取上清为封闭剂，备用；

(3)蒙脱石封闭活性炭的制备：以步骤(2)的封闭剂浸没步骤(1)的颗粒活性炭，在35-40℃下摇床中100-150rpm封闭2-4h，然后弃上清，烘干后得到蒙脱石封闭活性炭。

本发明提供的蒙脱石封闭活性炭的制备方法中蒙脱石为粉末状，其目数不小于300目。

本发明还提供根据上述制备方法得到的蒙脱石封闭活性炭在食品检测中的应用。