[发明专利]尼古丁选择性降解菌的构建方法及其在废烟叶水提液中的应用

说明书

本发明公开了一种尼古丁选择性降解菌的构建方法及其在废烟叶水提液中的应用，以Pseudomonas sp.JY‑Q为原始菌株，通过该菌全基因组信息分析，确定以下五个目的基因，构建目的基因的敲除载体，利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；将该菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，发生第二次交换的重组子——即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，以实现基因无缝敲除，直至敲除全部目的基因。本发明所得的菌株与野生型JY‑Q的表型差异，主要包括生长差异、尼古丁和葡萄糖降解差异。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，通过构建假单胞菌JY-Q(Pseudomonas sp.JY-Q)基因缺失菌株，使其在尼古丁和葡萄糖等共存环境中(如废烟叶水提液,TWE)选择性降解尼古丁。

背景技术

尼古丁(Nicotine),又名烟碱，由C、H、N三种元素组成，是一种含氮杂环有机化合物，其分子量为162.23Da，分子式为C₁₀H₁₄N₂，化学命名为1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷。室温下，尼古丁为一种淡黄色的油状液体，在光下久置易被氧化成暗灰色，有强烈的辛辣味，味苦，易挥发，腐蚀性强。常温常压下，尼古丁的密度为1.01g/mL，沸点为247℃，熔点为-79℃，易溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂中，能溶于水，在紫外波长259nm处有特征吸收峰。尼古丁是一种环境有毒物质，同时也是一种精神毒物。它对人类能产生致毒、致癌等多种不良效应，由于其可以透过生物膜和血脑屏障等膜系统，造成血液粘稠，流速降低，引发心绞痛，气管炎等疾病，严重时可引发心脏病导致死亡。并且，大量尼古丁的存在可以影响土壤生态结构和地下水，对土壤和环境造成严重污染，扰乱生态平衡。烟草及其废弃物是自然环境和人类生活环境中尼古丁主要污染来源。目前，利用微生物降解环境中各种有机污染物发挥着举足轻重的作用。

Pseudomonas sp.JY-Q分离自废烟叶水提液(TWE)，并显示出较好的尼古丁降解活性和TWE耐受适应性(详情见专利申请号：201310320679.8，中国典型培养物保藏中心保藏编号:M2013236)。然而,在实际利用假单胞菌JY-Q降解一定稀释度TWE中的尼古丁时，由于样品中存在另其它碳源(如葡萄糖),JY-Q会优先利用葡萄糖，从而对JY-Q尼古丁降解起到竞争性抑制作用。为避免TWE中其他营养物质的影响，同时在基本无机盐培养基(BSM)中添加尼古丁和葡萄糖进行降解尼古丁实验，结果也发现与葡萄糖共存时尼古丁完全降解所需时间比以尼古丁为唯一碳源时要多，证明了葡萄糖的存在对JY-Q降解尼古丁有抑制作用。迄今，国内外均未见关于葡萄糖与特定污染物(如尼古丁)共存时选择性降解污染物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效可行的方法，能够通过基因编辑技术对Pseudomonas sp.JY-Q菌株进行改造，使其成为在混合碳源环境中的尼古丁选择性降解菌。

本发明的另一目的是将前述的尼古丁选择性降解菌应用于复杂环境(如TWE)中高效降解尼古丁。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

尼古丁选择性降解菌的构建方法，以Pseudomonas sp.JY-Q为原始菌株，包括下述步骤：

1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下五个目的基因：一个葡萄糖激酶基因(AA098_22370)和四个葡萄糖脱氢酶基因(AA098_12490，AA098_22860，AA098_11910和AA098_05800)；

2)构建目的基因的敲除载体：设计待敲除目的基因上下游同源臂扩增引物(含约40bp敲除质粒部分序列)，在上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；