[发明专利]东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因

说明书

东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1‑A基因，属于动物生物技术领域，其特征在于东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1‑A基因的核苷酸序列如Seq ID No：1所示，将混有待测样品溶液的泌乳奶牛新鲜粪便分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中，于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力，结果7个小时后，混合物中氨氮含量为零，可见东方铃蟾肠道芽孢杆菌NESS1‑A基因的表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有较强除臭能力。

技术领域

本发明涉及一种东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因，属于动物生物技术领域。

背景技术

随着养牛业的快速发展，粪便污染已成为一大难题，一头奶牛每年产生的粪便在7吨以上。由于各地对牛粪的处理普遍重视不够，一些养牛比较集中的地方，基本上都没有牛粪处理设施，这就导致牛粪到处堆放，尤其到夏天，臭气冲天，既对周围居民的正常生活造成不良影响，同时，牛粪又是多种细菌病原体孳生繁殖的源头，对养殖群体有着严重的影响。另外，生牛粪上地，产生热量，消耗土壤氧气，导致烧根烧苗，还对寄生虫的卵、病原微生物起到传播作用。因此，牛粪处理显得十分重要。东方铃蟾(Bombina orientalis)是铃蟾科、铃蟾属的两栖纲脊椎动物，体长36-48mm，头扁平，吻圆，前、后肢短，皮肤粗糙，刺黑色，背部呈灰棕色，或背为绿色杂以不规则的黑色斑点，腹面有花斑，为黑色与朱红色或桔黄色。东方铃蟾为肉食性物种，可全天捕食，食物包括蚂蚁、姬蜂、蚊蝇类、鳞翅目幼虫、蝽类、甲虫、蜘蛛、田螺等蛋白质含量较高的动物，但是，东方铃蟾的粪便几乎没有臭味，其中，芽孢杆菌发挥了重要作用。如何在东方铃蟾粪便中寻找到能够处理粪便中氨氮的芽孢杆菌，找到表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的基因成为急需解决的一大难题？所以，发明东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因，寻找到一个表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因是必要的。

发明内容

为了克服如何在东方铃蟾粪便中寻找到能够处理粪便中氨氮的芽孢杆菌，找到表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的基因的难题，本发明提供了一个东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因，将实验用混合物置于光照培养箱中37℃培养，每隔1个小时，取出相应编号内的混合物，然后用氨氮测定仪测定混合物中的氨氮含量，计算表达蛋白对泌乳奶牛粪便的除臭能力；结果可知，7个小时后，混合物中氨氮含量为零，即该基因的表达蛋白将泌乳奶牛粪便中的氨氮全部清除掉，可见东方铃蟾肠道芽孢杆菌NESS1-A基因的表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有较强除臭能力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

东方铃蟾肠道芽孢杆菌表达蛋白对泌乳奶牛粪便具有强除臭能力的NESS1-A基因的核酸序列为Seq ID No：1，具体构建及验证过程如下：

1.基因的PCR扩增：将从中国黑龙江省帽儿山抓获的东方铃蟾肠道中提取的芽孢杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA使用Ness-5/Ness-3引物对进行PCR扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的NESS1-A基因编码区的N端和C端序列同源性，设计合成一对特异性引物NESS5/NESS3，分别在5’端引入NdeI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。根据全长基因的不同位点设计合成NESS51、NESS52、NESS31、NESS32四条引物，在5’端引入BamHI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于构建缺失基因。

2.PCR反应体系：KOD聚合酶反应体系50μL；KOD酶1μL；引物对(10mmol/L)1μL；模板1μL；10xPCR Buffer 5μL；MgSO₄ 3μL；dNTP 5μL；ddH₂O补足至50μL；

3.PCR反应条件(表2)