[发明专利]一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用

说明书

本发明涉及一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用，属于细胞体外分离扩增方法及其应用技术领域。包括以下步骤：1)、采集原因不明复发性流产患者配偶的外周血，梯度离心分离出外周血单个核细胞；2)、利用磷酸盐缓冲液洗涤所述外周血单个核细胞两次，并对获得的单个核细胞进行计数；3)、通过磁珠分选技术分离出CD4⁺T细胞、Treg细胞；4)、将Treg细胞进行扩增。本发明不仅可以获得纯度较高的Treg细胞，还可以通过体外扩增的方法获得临床应用所需要的细胞数量，本发明获得的人外周血Treg细胞应用于治疗不明原因复发性流产，能显著提高原因不明反复性流产患者的抱婴率。

技术领域

本发明涉及一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用，属于细胞体外分离扩增方法及其应用技术领域。

背景技术

复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)指患者与同一性伴侣连续发生2次及2次以上自然流产，在育龄妇女中发病率约为5％，此类患者再次妊娠失败率高达50％以上。RSA病因复杂，临床上约50％与染色体异常、生殖系统解剖异常、内分泌异常、感染和血栓形成倾向有关，另有50％RSA患者病因不明，称原因不明复发性流产(URSA)，被认为与母胎免疫排斥有关，是目前亟待解决的难治性不育症。

连续3次或3次以上流产患者(复发性流产)采用淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immunotherapy,LIT)于上世纪80年代在国际上获得成功，在临床上逐渐得到推广应用，并在国内取得共识。

近年研究表明，URSA与妊娠免疫耐受异常、生理性免疫抑制反应减弱有关，这涉及到CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞比例和Th1/Th2细胞比例失衡，调节性T细胞数量及功能下降，NK细胞毒力增强，巨噬细胞功能异常，HLA抗原组织相容性增加，封闭抗体产生减少等，从而导致胚胎遭受免疫排斥而流产。但是由于上述实验室指标变化不够敏感和稳定，尚未能作为URSA实验室诊断指标，所以URSA的诊断主要靠临床排除性诊断，没有确切的实验室诊断指标。

申请人自2007年致力于URSA及反复种植失败的研究。近年来，申请人在2项国家自然科学基金、2项生殖医学基金的资助下，深入开展URSA的临床及基础研究，在其发病原因、发病机制、免疫防治、规范诊疗等方面上取得了一定的成绩。前期研究中，1)我们首次提出母胎“Th17/Treg平衡”理论，我们认为正常妊娠存在Th17/Treg平衡，URSA患者Th17/Treg失衡，偏向Th17；URSA患者外周血、蜕膜中Treg细胞(细胞表面标志CD4+CD25+CD127dim/-)表达降低，确定Treg细胞的表面标志，为URSA患者病因学筛查临床检验提供可靠依据(Wanget al.,2010)。2)URSA患者Treg细胞调控Th17细胞功能降低，Th17细胞表面趋化因子及细胞因子表达异常(Wang et al.,2010)。3)URSA患者巨噬细胞功能异常、Treg细胞调控巨噬细胞的功能异常，正常妊娠妇女Treg细胞能够有效调控URSA患者Th17、巨噬细胞功能(Wanget al.,2011)。4)注射rIL-17能引起鼠种植率降低、流产率增加，转输正常孕鼠Treg细胞能提高种植率及妊娠成功率(Wang et al.,2014)。6)种植期Treg细胞水平、体外倍增的能力以及细胞因子的分泌与种植成败关系密切，反复种植失败患者种植期外周血Treg细胞表达降低(Wang et al.,2017)。7)Treg细胞免疫治疗URSA患者，提高了抱婴率(Wang et al.,2017ARSImeeting)。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足之处,提供一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法，通过本方法不仅可以获得纯度较高的Treg细胞，还可以通过体外扩增的方法获得临床应用所需要的细胞数量首次应用于治疗原因不明复发性流产。