[发明专利]一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用

权利要求书

1.一种生产对羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述方法是利用重组大肠杆菌以苯酚为底物进行生产；其中，所述重组大肠杆菌同时表达了外源酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因；所述酪氨酸酚裂解酶、L-乳酸脱氢酶是通过pETDuet-1载体共表达的；所述酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶是通过pACYCDue-1载体共表达的；所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1序列，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2，所述酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_011339422.1的序列；所述酚类化合物分解相关的基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合；所述酚类化合物分解相关的基因hpaD、mhpB的核苷酸序列分别是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION: 4505585..4506436和NC_012892 REGION:339806..340750。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、NAD合成基因、磷酸吡多醛合成基因一种或者多种；所述强化表达的基因为乳酸转运基因lldP、苯酚转运基因hpaX、苯酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ中的任意一种或多种；所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION: 3646638..3648293；hpaX为；NC_012892 REGION: 4502025..4503401；mhpT为NC_012892 REGION: 344788..345999；nadA为NC_012892 REGION: 740487..741530；pdxJ为NC_012892 REGION:2567591..2568322。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为Escherichia coliBL21(DE3)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产是进行全细胞转化生产；所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。

6.权利要求1-5任一所述方法在制备对羟基肉桂酸的应用。

7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括：在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了乳酸转运基因lldP、苯酚转运基因hpaX、苯酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶和NADH氧化酶；所述酪氨酸酚裂解酶、L-乳酸脱氢酶是通过pETDuet-1载体共表达的；所述酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶是通过pACYCDue-1载体共表达的；所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1序列，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2，所述酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_011339422.1的序列；所述酚类物质分解基因hpaD、mhpB的核苷酸序列分别是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:4505585..4506436和NC_012892 REGION:339806..340750；所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892 REGION: 4502025..4503401；mhpT为NC_012892REGION: 344788..345999；nadA为NC_012892 REGION: 740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:2567591..2568322。