[发明专利]基于恒温扩增的人乳头瘤病毒引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了基于恒温扩增技术的快速检测人乳头瘤病毒的引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法。本发明所述引物和分子信标组合如SEQ ID No.1‑17所示，可特异性的识别13种不同类型的高危HPV病毒、2种中国人群发病率较高的中危基因型。本发明所述试剂盒及基于恒温扩增技术荧光实时检测人乳头瘤病毒的方法，能在较短的时间内(1.5h)检测出15种中高危型HPV病毒，准确性好，灵敏度高，重复性强，特异性好，与临床上类似病原物均没有非特异性反应，而且使用方便，只需将提取的模板样本加入反应管中，人工操作时间少于5min，而且恒温扩增对仪器的温度控制要求不高，能够很好地应用于即时检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人乳头瘤病毒病原微生物的检测，具体涉及一种基于恒温扩增技术，快速检测人乳头瘤病毒的引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，据统计70％～80％的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80％。低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。

目前针对人乳头瘤病毒的实验室诊断方法有宫颈细胞学、阴道镜、组织病理学检查和核酸检测技术。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的筛查方法，可发现早期病变。但宫颈细胞学检查存在其固有的局限性。高危型HPV核酸检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检查敏感性，并降低筛查频率。

HPV核酸检测技术，目前主要以荧光定量PCR检测(中国发明专利CN201410431759.5、中国发明专利CN201410299192.0、中国发明专利CN201510518350.1等)、数字PCR检测(中国发明专利CN201510462453.0)、反向点杂交检测(中国发明专利CN201710286981.4)、连接酶检测(中国发明专利)等。但上述专利对仪器要求较高，需要严格的温度控制，不适合HPV的即时检测(point-of-care testing，POCT)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基于恒温扩增技术的快速检测人乳头瘤病毒的引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法。

本发明针对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种高危基因型、以及中国人群发病率较高的53、66这2种中危基因型HPV病毒L1区域，设计特异性引物和分子信标组合，特异性的识别13种不同类型的高危HPV病毒、2种中国人群发病率较高的中危基因型。