[发明专利]一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体

说明书

本发明提供了一种用于哺乳动物宿主细胞表达蛋白/多肽的表达载体，包含标记基因和用于插入目的基因的限制性内切酶酶切位点，目的基因后的Poly(A)加尾信号数量为2个或2个以上，标记基因的启动元件仅为TATA框。本发明提供的表达载体的选择标记基因的上游含有两个或以上的Poly(A)加尾信号，使上游强启动子对下游TATA框活性的干扰最小化，以驱动选择标记基因表达。本发明的表达载体可在短时间内产生用于重组蛋白质表达的稳定且高产的细胞系，并且基因扩增不需要药物选择/介导，可以在没有任何药物诱导扩增的条件下直接选择，这些细胞系可长期稳定表达高水平的重组蛋白，非常适用于工业化生产蛋白或多肽。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于哺乳动物细胞表达蛋白/多肽的表达载体，特别涉及一种能够用于工业化生产的表达重组免疫毒素的表达载体。

背景技术

抗癌药制药业中规模最大，增长最快的市场之一；市场在全球范围内不断扩大，对更有效且耐受性更好的癌症疗法的需求也越来越高。靶向药市场一直在以显着的速度增长，并且在发达和新兴地区市场上持续增长的潜力很大。单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb）比小分子（化学）药物（化学疗法）具有很大的优势，可高度特异性识别癌细胞表面标记。因此，单克隆抗体副作用通常较少或较温和，特别是人源化单抗，会带来更好的生活质量（如体重和脱发方面）。

赫赛汀（注射用曲妥珠单抗，Herceptin）是由Genentech Inc.（基因泰克）开发的市场上的单克隆抗体，其靶向Her-2用于治疗乳腺癌患者。2016年，这种药在美国每年产生超过30亿美元的收入。但是抗体本身不杀死癌细胞；因此赫赛汀的功效是有限的。Her-2阳性乳腺癌患者中仅有一小部分（约15％）对该药物有反应。尤其是单独使用的临床结果不理想，最终的生存率并没有改变；由于存在免疫妥协宿主，同时也造成了疗效有限；由于mAb生产使用哺乳动物细胞使得生产成本非常高。虽然开发单克隆抗体可以获得高额利润，但是单位产品（以克为单位）价格很高，普通健康保险不会涵盖此类药物，因此，从长远来看其社会经济效益不好。

基因泰克公司进一步开发了赫赛汀与化学毒素（DTM1）的结合物，引领了下一代基于单克隆抗体的疗法的开发，该疗法在成功进行III期临床试验后获得了FDA批准。许多其他制药公司也开始开发mAb-化学毒素偶联物（Antibody Drug Conjugates，ADC）直接特异的杀死癌细胞。但单克隆抗体和化学毒素的结合需要一个额外的步骤而且还需要纯化；mAb-毒素结合物在体内不稳定，降解后会释放游离的化学毒素，释放的化学毒素可以扩散到细胞内，杀死正常的非癌细胞，造成严重的副作用。因此，重组免疫毒素（rIT）是最终的选择。

重组免疫毒素是通过使用与蛋白质毒素偶联或融合的抗体或抗体片段进行靶向治疗的实例。蛋白质毒素只进入与抗体结合的特定细胞，然后杀死这些细胞，而在细胞外无毒性作用。如果靶细胞表面分子或表位限于特定细胞类型如癌细胞，则这种类型的药物是高度细胞类型特异性的。而且rIT可以直接在大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母或哺乳动物细胞中产生，一次性生产、不需要再合成，成本要低得多；而针对癌细胞的细胞毒性要比化学毒素高得多；同时，rIT是单分子蛋白，在体内不会产生游离出非靶标的毒素。降解后的毒素片段也不能直接进入到细胞内。