[发明专利]一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用

说明书

本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。本发明还提供了一种上述芯片的制备方法。本发明还提供了同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒及检测方法。本发明将酶促反应和基因芯片技术相结合，能够快速检测和鉴别诊断四种猪腹泻病毒病，特异性好，准确度高，且检测结果肉眼可见，为猪病毒性腹泻的防控提供一种新的诊断技术；而且本发明芯片的制备方法简单、成本低，可应用于临床疫病的大量检测，为保障我国养猪业的健康发展提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用。

背景技术

近年来，猪传染性腹泻疾病的发生与流行日益严重，给广大养殖户造成了难以估量的经济损失。目前在我国猪传染性腹泻疾病的病毒原主要是猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、猪A群轮状病毒(Group A rotavirus，GAR)。这三类病毒所引起的疫病发生后外观特征基本相似，均表现为呕吐、水样喷射腹泻和脱水等，特别是哺乳仔猪发病严重且死亡率高。猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)于2012年首次在香港被报道出有猪场发现该病毒，随后于2014年在美国俄亥俄州和伊利诺伊州报道出有猪场发现该种病毒，此后至少有19个州都有该种病毒的报道。PDCoV主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎病伴随有小猪的腹泻和呕吐。由于腹泻病毒常常出现混合感染的情况，且临床鉴别诊断较困难，开展四种猪腹泻病毒的同步鉴别诊断对防控具有重要意义。

目前，针对病毒性疾病的诊断方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法(免疫电镜法、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA))以及分子生物学检测技术(原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(RT-PCR))等，这些方法虽然得到了一定的应用，但在诊断混合感染中仍然存在不足。例如病毒分离不易成功，血清学检测灵敏性低，检测过程中容易出现交叉反应，分子生物学检测的样本数量有限导致无法实现样品高通量的快速检测。而相比于传统检测方法，基因芯片技术作为一种新型的高通量检测技术，具有操作简单、准确性高、灵敏度强等常规方法无法比拟的优点，适合对多种病原的快速检测。

可视化基因芯片是在常规基因芯片的原理上，根据各病毒的保守基因序列，利用生物软件设计特异性探针，按照一定规律点样在玻璃片或者膜片上，水合之后形成可以长期保存的芯片。在PCR引物的5’端引入生物素，在辣根过氧化物酶上引入链霉亲和素，利用生物素-链霉亲和素反应使酶和二氨基联苯胺(DAB)特异性显色反应而放大信号，形成肉眼可见的结果。该检测平台特异性好，高通量，灵敏度高，能应用于临床样品，更加适用于基础实验室及临床检测。它不仅有普通生物芯片高通量的特性，又有操作简便、经济实惠的特点，这使它在科研和临床中有着广泛的应用并为高通量分子鉴别诊断提供了新的良好平台。

目前利用可视化基因芯片技术检测猪腹泻病毒的报道仅见本团队马锐前期研究等，猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用，农业生物技术学报，2016,24:1233-1242，该方法仅能检测三种特定的猪腹泻病毒；而且使用的可视化芯片是以玻片做固相载体，在制备时需要进行水合处理，该方法不仅成本高，且操作步骤复杂，耗时长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用。

本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含：SEQ ID NO：1-2所示探针、SEQ ID NO：3-4所示探针、SEQ ID NO：5-6所示探针、SEQ ID NO：7-8所示探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。