[发明专利]一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法

说明书

本发明公开了一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法。该方法主要通过慢病毒构建稳定细胞系的方式，使得在NF‑κB反应元件或者IFN‑β启动子控制下的荧光素酶基因稳定表达在人上皮细胞A549细胞中，然后通过流式筛选得到单克隆，进一步筛选对LPS有反应的阳性克隆子，最后使用细菌内毒素标准品刺激并同时和鲎试剂进行比较，从而建立了一种新的使用上皮细胞系检测热原的方法。所述的上皮细胞系检测热原的方法不需要使用动物就能够真实地模拟人体对热原的反应，并且能够对的分布范围极为广泛的LPS有较强的反应，灵敏度高，稳定性好，而且A549细胞市售易得使该热原检测方法简单易行。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及药品和生物制品(包括基因工程制品)中热原的检测技术领域.

背景技术

热原是一类在宿主体内可以引起发热和诱导炎症反应的异构类化合物。药品和医疗器械热原的污染是系统性炎症最常见的原因，甚至更糟糕的是会引起败血性休克(Palma,L.,et al.Assay Drug Dev Technol,2017.15(2):64-76.；Gimenes,I.,etal.Regul Toxicol Pharmacolm,2015.73(1):356-360.)。大多数为我们所知道的热原是微生物来源的，包括细菌，酵母，真菌，病毒和它们的组分以及环境颗粒(Daneshian,M.,etal.J Immunol Methods,2008.336(1):64-70.)。研究最好的是细菌细胞壁的组分，例如革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS，也被称为内毒素)或者革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)(Daneshian,M.,et al.J Immunol Methods,2008.336(1):64-70.；Stang,K.,etal.J Mater Sci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.)，这些热原物质会刺激宿主的白细胞去释放炎症细胞因子和导致严重的反应，如多器官衰竭，败血性休克甚至死亡(Stang,K.,et al.J Mater Sci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.；Hasiwa,N.,M.Daneshian,and T.Hartung,2013.30(2):169-209.)。因此，热原检测是一个医药产品的先决条件。目前，几种不同的检测热原方法可以被获得，分别是家兔热原检测法(RPT)，细菌内毒素检测法(BET，也被称为鲎试剂法(LAL))，和单核细胞检测法(MAT)(Stang,K.,et al.J MaterSci Mater Med,2014.25(4):1065-1075.)。

家兔热原检测法(RPT)，一个黄金的热原检测标准，它是基于在静脉注射待检测的溶液或者移植医疗器械之后观察家兔温度的上升情况(Stang,K.,et al.J Mater SciMater Med,2014.25(4):1065-1075.；Su,W.and X.Ding,2015.20(4):354-364.)。在二十世纪初，由于家兔对热原的灵敏度和人类的灵敏度是相似的(Vipond,C.,et al.,ALTEX,2016.33(1):47-53.)，因此，RPT被应用于检测不同类型的热原污染(Palma,L.,etal.Assay Drug Dev Technol,2017.15(2):64-76.)。然而，家兔的灵敏度容易受到很多因素影响，例如家兔的品系，年龄和性别以及饲养条件等(Stang,K.,et al.J Mater SciMater Med,2014.25(4):1065-1075.)。而且，RPT是既昂贵又费时的。除此之外，家兔法仅仅是定性检测而不是定量的(Hasiwa,N.,M.Daneshian,and T.Hartung,2013.30(2):169-209.)。