[发明专利]一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法有效
| 申请号： | 201810317034.1 | 申请日： | 2018-04-10 |
| 公开（公告）号： | CN108707626B | 公开（公告）日： | 2021-10-01 |
| 发明（设计）人： | 方敏;李凯莉;王滔;徐赫男;姜威;李晶;刘文军;段学锋 | 申请（专利权）人： | 中国科学院微生物研究所;安徽大学;中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京律和信知识产权代理事务所(普通合伙) 11446 | 代理人： | 武玉琴;刘国伟 |
| 地址： | 100101 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 检测 单克隆 细胞系 制备 方法 | ||
1.一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将NF-κB结合位点或者IFN-β启动子序列组装到可表达嘌呤霉素的慢病毒表达载体中，构建含有NF-κB结合位点或者IFN-β启动子序列的重组质粒；
（2）将步骤(1)得到的重组质粒稳定转染到上皮细胞系中；
（3）将步骤(2)得到的上皮细胞系使用嘌呤霉素筛选，并用流式分选单克隆细胞；
（4）将步骤(3)得到的单克隆细胞使用高剂量的LPS刺激，其中对LPS有反应的则为NF-κB或者IFN-β阳性克隆；
（5）将步骤（4）得到的阳性克隆使用更低剂量的LPS刺激，得到极灵敏的阳性克隆细胞；
所述慢病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1系列载体；
所述上皮细胞系为人肺泡上皮细胞A549。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NF-κB结合位点或者IFN-β启动子序列分别克隆自pNFκB-luc 或者pGL3-Control 质粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高剂量的LPS，其浓度为500ng/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对LPS有反应是通过荧光素酶报告实验测定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的更低剂量LPS，其浓度分别为1,10,50，100 ng/ml或者10,25，50，100 ng/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LPS刺激，其时间为6h。
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