[发明专利]一种血浆样品前处理技术结合UPLC-MS/MS测定健康人血浆中头孢地尼含量的方法

说明书

本发明具体涉及一种血浆样品前处理技术结合UPLC‑MS/MS测定人血浆中头孢地尼含量的方法，属于体内药物痕量分析领域。血浆样品经10%三氯醋酸沉淀蛋白后，以超高效液相色谱‑质谱（UPLC‑MS/MS）为检测工具，直接测定人血浆中头孢地尼的含量。本发明对检测条件进行了考察和优化，建立了最优的UPLC‑MS/MS分析方法，并成功运用于实际血浆样品的测定。与传统方法相比，本方法具有灵敏度高、分析速度快、重现性好等优点。

技术领域

本发明属于体内药物痕量分析领域，特别地提供一种新的样品前处理技术和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合UPLC-MS/MS直接测定健康人血浆中头孢地尼的浓度的分析方法的建立。

背景技术

头孢地尼（Cefdinir）是日本藤泽药品株式会于1988年首次合成的第三代口服头孢类抗菌药物，在水、乙醇或乙醚中不溶。与其他第三代口服头孢菌素相比，头孢地尼口服吸收性好，对β-内酰胺酶具有高度稳定性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌属、链球菌属等的抗菌活性明显增强，临床上用于治疗皮肤感染，术后伤口感染，呼吸道感染等。

样品前处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难、最繁琐的工作。前处理是为了除去生物介质中含有的大量内源性及外源性干扰物质，因此，样品的前处理是关系到分析结果准确性的重要步骤。根据国内外文献报道，头孢地尼血浆样品前处理方法应用最多的是固相萃取法和蛋白沉淀法。但固相萃取法成本较高，耗时较长；蛋白沉淀法操作简便易行，血浆用量少，避免了提取物处理的损失，回收率高。本发明尝试以10%三氯醋酸于96孔板中沉淀蛋白，离心后，移液工作站提取上清后直接进样。该法萃取效果好、专属性强且重现性好、样品处理时间短、节省时间和试剂，适合药物代谢动力学研究中大量血浆样品的前处理，以求在体内药物分析领域成为最省时、省力、省财的分析技术，并致以推广于其他领域。

目前，国内外头孢地尼血药浓度测定方法主要有微生物法，HPLC-UV法和LC-MS/MS法。但这些方法都存在一定的局限性，如微生物法过程复杂，操作繁琐，而且灵敏度也较低；HPLC-UV法灵敏度较低，样品保留时间较长。本发明建立了一套完整的UPLC-MS-MS法测定健康人血浆中痕量的头孢地尼，定量下限可达5 ng/mL，灵敏度相对较高；头孢地尼和内标头孢克洛的保留时间均在4 min左右，大大缩短了保留时间，分析速度快，峰形也较好；本法具有操作简便、快速准确等特点，适于健康人血浆中痕量的头孢地尼的测定。

发明内容

本发明的目的在于减少血浆样品前处理时间和提高分析灵敏度，提供一种血浆样品中头孢地尼新的分析测定方法。本发明采用96孔板中沉淀蛋白结合移液工作站的前处理技术，并利用UPLC-MS/MS液质联用为分析仪器，该方法克服了现有方法有机试剂消耗大、处理时间长、干扰多以及检测限等的不足，灵敏度高，分析速度快，结果灵敏准确，干扰少，重复性和重现性好。

本发明是通过以下技术方案实现上述目的：

一种血浆样品前处理技术结合UPLC-MS/MS测定人血浆中头孢地尼的方法，减少干扰、降低有机溶剂用量和检测限等，选择最优的条件提高对头孢地尼的回收率和重现性，其具体步骤如下：

（1）血浆样品的前处理

于96孔板中先加入血浆样品，再依次加入内标溶液和三氯醋酸溶液，涡旋，离心，移液工作站取上清液，再次离心，直接于UPLC-MS/MS分析；

（2）UPLC-MS/MS测定人血浆样品中头孢地尼的含量

超高效液相色谱分离

有机相为甲醇或乙腈等（B），水相为水缓冲溶液（A），采用B相：A相大约在30:70-10:90的范围内（V/V）的等度比例洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为40℃；

质谱检测