[发明专利]一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合

说明书

本发明公开了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法以及相应的引物和探针。本发明首次建立了一种可快速区分鸭坦布苏病毒野毒株与疫苗株(WF100株和FX2010‑180P株)的荧光PCR检测方法，该检测方法操作简单，全部操作过程不需3小时，显著缩短了病毒野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

技术领域

本发明涉及鉴别鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株技术领域，尤其是用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合、试剂盒以及方法。

背景技术

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusuvirus，DTMUV)引起的一种新的鸭传染病，感染率达100％，发病率和死亡率为5％～30％，主要表现为生长缓慢、高热、食欲下降、产蛋量急剧下降甚至停止、病鸭死亡等临床症状，对我国养鸭业造成了严重的经济损失。DTMUV为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类恩塔亚病毒群。DTMUV不仅可以感染鸭，还可以感染鸡、鹅、麻雀等禽类，甚至从蚊子中分离到病毒，在人血清和口腔拭子中也检测到DTMUV抗体和病毒核酸。

由于目前尚无有效的治疗方案，接种疫苗仍然是预防该疾病流行的最有效方式。已经获批的鸭坦布苏病毒疫苗包括灭活疫苗HB株及活疫苗WF100株，另外还有2014年11月临床试验申请获批的FX2010-180P株等。由于活疫苗在临床使用存在一定的毒力返强及排毒风险，故接种活疫苗对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度，从而影响其疾病治疗效果。有必要建立针对鸭坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别检测方法。

目前对DTMUV的检测主要有病毒分离鉴定、套式RT-PCR、RT-LAMP、荧光定量RT-PCR、双抗体夹心ELISA，未检索到DTMUV野毒株与疫苗株的鉴别检测方法。因此，建立一种疫苗株与野毒株的鉴别检测方法具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，本发明还提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合，所述引物的核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-ATAACAGTCAACCCATACGTGTC-3'；

引物R：5'-CACTTCTATGCCACTGGTACCT-3'；

所述探针的核苷酸序列：5'-CCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCG-3'，其中，所述探针的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团。

优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的至少一种，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的至少一种。

本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物和探针的组合。

优选地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品包括DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及FX2010-180P株的核酸。

本发明提供了一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的方法，包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒RNA；

(2)以步骤(1)提取的病毒RNA为模板，以DTMUV野毒株的核酸、DTMUV活疫苗WF100株的核酸及DTMUV活疫苗FX2010-180P株的核酸作为阳性对照，采用上述所述的引物和探针的组合进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；