[发明专利]一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法

说明书

本发明公开了一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株，外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成，进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生NADH的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛‑3‑磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸NAD⁺脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，重组菌株BSGNKAP8乙酰氨基葡萄糖的产量为24.50g/L，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株BSGNKAP2的1.97和2.13倍。

技术领域

本发明涉及一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖反应式为：

5/2glucose+ATP+5NAD⁺+2NH₃→GlcNAc+glutamate+ADP+5NADH+2CO₂+phosphate

该方程是通过计算从头合成乙酰氨基葡萄糖的3个前体6磷酸果糖、乙酰辅酶A和谷氨酰胺得到，从方程中可以看出在乙酰氨基葡萄糖合成的过程中伴随着大量的NADH的产生。过量生成的NADH对N-乙酰氨基葡萄糖途径最大理论得率(Yc)产生巨大的消极影响。因为细胞要维持还原力平衡，过量产生的NADH将通过两种方式消耗，一个参与其他代谢的合成(导致副产物的产生)，另外一方面被氧化产生ATP(导致发酵过程需要消耗大量O₂，同时也会造成菌体量大量生成)。此外，利用枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖时会伴随着代谢溢流，导致副产物乙偶姻的大量合成。因此，如何有效处理在伴随乙酰氨基葡萄糖生成的NADH及乙酰氨基葡萄糖合成效率，同时避免中心碳代谢溢流，提碳原子经济性，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，该构建方法是外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生NADH的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸NAD+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白。操作简单，便于使用，且所构建的重组枯草芽孢杆菌完全避免中心碳代谢以溢流、平衡胞内还原力NADH代谢。

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌整合表达了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gapN、异柠檬酸NAD⁺脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porAB和固氮酶铁蛋白cyh。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP2如专利申请号为CN201610517961.9的专利申请所述。