[发明专利]基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法。本发明提供了敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，质粒转染SK‑N‑SH细胞后，制备单克隆，Cruiser^TM Enzyme酶切后疑似为阳性克隆，单克隆测序结果显示SK‑N‑SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功；并且，在CAPNS1^‑/‑组，CAPNS1蛋白及Calpain1和Calpain2蛋白水平明显降低。结果表明SK‑N‑SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及敲除人神经母细胞瘤细胞 CAPNS1基因的方法。

背景技术

钙蛋白酶(calpain)是一组高度保守的特异性Ca²⁺依赖性细胞内中性蛋白酶，其活性主要与细胞内Ca²⁺浓度有关。calpain在机体的生理过程中发挥着重要作用，其不仅与细胞内蛋白质的水解关，还参与细胞自噬、细胞周期调控与凋亡、细胞骨架重构、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程[3,4]。自在大鼠的脑组织中首次发现一种可溶的Ca²⁺依赖的中性蛋白酶以来，研究者们越来越关注这种蛋白酶在体内的作用。目前，研究发现在哺乳动物中calpain 存在15种亚型，其中，calpain1(μ-calpain)和calpain2(m-calpain)在体内广泛表达，且研究也较为广泛。Calpain1和calpain2主要由80kD的大亚基和30kD的小亚基(calpain-s1，CAPNS1)组成，CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是细胞迁移，凋亡和存活所必需的。

人神经母细胞瘤细胞(human neuroblastoma cell,HNC)是研究神经系统基因功能和神经毒性机制的良好的体外模型，建立敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞模型有利于对CAPNS1蛋白的作用的进一步研究，更有利于对神经系统多种疾病机理的研究。

基因敲除是通过DNA序列改变，出现基因功能的“全或无”表象。基因沉默技术是以不改变DNA序列为前提，使基因沉默，即基因不表达或低表达。基因编辑技术是指在基因组水平精确地进行基因编辑，其是通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除、加入等过程。基因敲除构建出的突变型细胞系比基因沉默构建的细胞系稳定。细胞基因沉默的效率并不总是非常高，也不十分稳定，影响实验结果敏感性和可靠性。

继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)基因编辑技术之后，第三代基因编辑技术CRISPR/Cas技术是目前运用最为广泛的基因技术。CRISPR/Cas是一种来源于原核生物适应性免疫系统，通过人工改良而得。相比ZFN和TALENs，CRISPR/Cas技术具有成本低、可同时进行多位点编辑、效率高等优势。CRISPR/Cas系统分为3种，其中II型最为简单，研究得也较多。该系统主要包含非特异性Cas9核酸酶和sgRNA两部分，其中sgRNA具引导和检测作用；Cas9是一种RNA依赖的DNA内切核酸酶，其利用单一向导 RNA(sgRNA)使双链DNA断裂，起到剪刀作用。

脱靶效应是存在于所有基因组靶向修饰技术中的一道难题，它会对基因组非特性序列进行切割，造成未知突变，增加后期的鉴定工作量。CRISPR/Cas9 系统中，对靶序列的识别主要是依靠一段20bp的短RNA，但是研究表明当存在单个甚至多达5个碱基错配时，切割仍能正常发生。进一步研究发现，在这20bp中只有位于PAM位点前12bp的种子序列对靶位点识别影响较大，即总共只有14bp(PAM中的GG和种子序列)是靶位点识别的关键序列。这在生物体庞大的基因组中很容易出现脱靶位点，从而引入意外突变。除此之外，Cas9蛋白或sgRNA的浓度也对脱靶活性产生影响。