[发明专利]用于检测有机磷农药的突变酶及制备方法

说明书

本发明提供了一种检测有机磷农药的突变酶，所述突变体酶为人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W。本发明提供的检测有机磷农药的突变酶，对多种有机磷农药具有较好的识别效果，且具有较高的动力学常数，可以同时实现多种有机磷农药种类的鉴别及其含量的检测。此外，有机磷农药外的其他有机磷化合物对所述人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W的抑制较小，假阳性的干扰小，检测准确性较高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测有机磷农药的突变酶及其制备方法。

背景技术

有机磷农药因具有效率高、品种多、用途广等特点而被广泛使用。有机磷农药的使用，对农业生产上作物保护起了巨大的作用，但同时，由于有机磷不易氧化、分解，也难被微生物降解，能长期在环境中滞留，因此，有机磷农药的大量使用，造成了环境污染。此外，部分有机磷品种属于高毒类，对非靶向生物体毒性严重，有机磷农药在食物、环境中的残留，不仅威胁人类健康，还造成生态系统中有益生物和人畜的伤害。因此，加强对环境、食品中的有机磷农药含量的检测，发展能够即时、快速检测有机磷农药含量的方法就显得十分重要。

检测有机磷农药残留的常用方法较多，主要分为：光谱法、色谱法、酶抑制法，这些检测方法各有利弊。目前广泛用于检测的酶生物传感器就是利用酶抑制法开发研制而成的。其中检测所使用的酶源为乙酰胆碱酯酶AChE。AChE作为重要的酶源在检测有机磷农药残留的过程中仍存在以下问题：首先，采用AChE进行检测只能检测到有机磷农药的总量，无法分别检测到各个不同有机磷的含量；其次，除有机磷农药外，氨基甲酸酯类化合物也能够抑制AChE，这样会对检测带来假阳性的干扰；此外，由于有机磷类农药数量庞大，不是所有有机磷化合物都能被AChE识别，这样会遗漏部分有机磷农药分子的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测有机磷农药的突变酶及其制备方法和应用，旨在解决现有采用乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药时无法区分有机磷的种类及其含量，且存在假阳性干扰的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种检测有机磷农药的突变酶，所述突变体酶为人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W。

本发明的另一方面提供一种检测有机磷农药的突变酶的制备方法，包括以下步骤：

提供包含计划定点突变序列的正反引物，以重组质粒为模板，采用PCR定点突变技术进行突变后，采用DpnI消除模板双链和杂合态模板，收集突变的单链环状DNA，所述计划定点突变序列为第328位的A突变为W的人源丁酰胆碱酯酶；

提供负载突变单链环状DNA的质粒，在-4℃～-80℃的条件下，将所述质粒加入到感受态细胞中，冰浴20-30min后，在40℃～45℃水浴条件下热击50-60s；冰浴处理后，加入培养基进行摇床培养；

取摇床培养的细胞液涂板培养，富集单菌落；取所述单菌落置于液体培养基中，摇床培养后，提取并纯化质粒；

提供人体胚肾细胞HEK293，将质粒DNA在所述人体胚肾细胞HEK293中转染表达，采用阴离子交换柱对转染表达后的初酶液进行纯化，得到人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W。

以及，上述的突变酶以及上述方法制备的突变酶在检测有机磷农药领域的应用。

本发明提供的检测有机磷农药的突变酶，对多种有机磷农药具有较好的识别效果，且具有较高的动力学常数，可以同时实现多种有机磷农药种类的鉴别及其含量的检测。此外，有机磷农药外的其他有机磷化合物对所述人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W的抑制较小，假阳性的干扰小，检测准确性较高。

本发明提供的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，突变效果好，突变处理后的单链环状DNA样品纯度为100％；经过转化、转染表达后纯化后，得到的人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W纯度高，在90％以上。

附图说明