[发明专利]用于检测有机磷农药的突变酶及制备方法

权利要求书

1.一种检测有机磷农药的突变酶，其特征在于，所述突变体酶为人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W。

2.如权利要求1所述的检测有机磷农药的突变酶，其特征在于，所述有机磷农药包括乙基对氧磷、敌敌畏、丙溴磷、辛硫磷中的至少一种。

3.一种检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供包含计划定点突变序列的正反引物，以重组质粒为模板，采用PCR定点突变技术进行突变后，采用DpnI消除模板双链和杂合态模板，收集突变的单链环状DNA，所述计划定点突变序列为第328位的A突变为W的人源丁酰胆碱酯酶；

提供负载突变单链环状DNA的质粒，在-4℃～-80℃的条件下，将所述质粒加入到感受态细胞中，冰浴20-30min后，在40℃～45℃水浴条件下热击50-60s；冰浴处理后，加入培养基进行摇床培养；

取摇床培养的细胞液涂板培养，富集单菌落；取所述单菌落置于液体培养基中，摇床培养后，提取并纯化质粒；

提供人体胚肾细胞HEK293，将质粒DNA在所述人体胚肾细胞HEK293中转染表达，采用阴离子交换柱对转染表达后的初酶液进行纯化，得到人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W。

4.如权利要求3所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，将所述质粒DNA在所述人体胚肾细胞HEK293中转染表达的方法，包括：

将所述人体胚肾细胞HEK293接种，培养至细胞汇合度≥90％，去除培养基并进行清洗处理；

用无血清培养基稀释脂质体Lip2000，先后加入转染溶液和质粒DNA混合，得到混合液，其中，所述转染溶液为OPTi-MEM，所述脂质体和所述质粒DNA的质量比为1:1～1:2；

将所述混合液加入所述人体胚肾细胞HEK293中，培养箱中培养4-6h后，加入完全培养基继续培养3-4d。

5.如权利要求3所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，采用阴离子交换柱对转染表达后的初酶液进行纯化的步骤，包括：

提供DEAE52阴离子交换柱，采用浓度为0.02mol/L、pH＝7.4的Tris-Cl缓冲液进行平衡处理，将所述初酶液浓缩后上样，收集流出液，将所述流出液重复上样-收集，直至收集的液体经考马斯亮蓝检测不呈现蓝色为止；

采用NaCl的Tris-Cl缓冲液进行梯度洗脱，收集各馏分洗脱液，经检测收集富集人源丁酰胆碱酯酶突变体A328W馏分。

6.如权利要求3-5任一项所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，采用PCR定点突变技术进行突变的PCR扩增体系为：

7.如权利要求6所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，采用PCR定点突变技术进行突变的PCR反应条件为：

94℃，30s；

94℃，30s；55℃，30s；68℃，12min；20个循环；

68℃，12min。

8.如权利要求3-5任一项所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，在提取并纯化质粒后，还包括对纯化后的质粒进行测序和酶切验证。

9.如权利要求3-5任一项所述的检测有机磷农药的突变酶的制备方法，其特征在于，将质粒DNA在所述人体胚肾细胞HEK293中转染表达后，还包括将得到的初酶液采用SDS-聚丙烯凝胶电泳进行检测。

10.如权利要求1或2所述的突变酶以及如权利要求3-5任一项所述方法制备的突变酶在检测有机磷农药领域的应用。