[发明专利]一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法

权利要求书

1.一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将卡那霉素适体(APT_KNA)与生物素标记的探针CP_KNA退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SP_KNA和HP_KNA修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面；当体系中存在卡那霉素(KNA)时，KNA与APT_KNA的特异性结合并使APT_KNA脱离SDB，紧接着CP_KNA则与AuNPs修饰的HP_KNA杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP_KNA结合SAv-HRP后可催化OPD-H₂O₂溶液变色，利用450nm处紫外吸光度的变化与卡那霉素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现卡那霉素浓度的检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中卡那霉素的灵敏测定。

2.根据权利要求1所述的一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法，其特征是将卡那霉素适体(APT_KNA)与生物素标记的探针CP_KNA退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，将20μL 10μM APT_KNA和20μL 10μM CP_KNA加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为7.0的10mM PBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CP_KNA/APT_KNA修饰好的SDB重悬于50μL pH值为7.0的10mM PBS溶液中。

3.根据权利要求1所述的一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法，其特征是生物素修饰的探针SP_KNA和HP_KNA通过巯基修饰在AuNPs表面，将制备的AuNPs 100μL加入4μL 10μM的HP_KNA、40μL 10μM的SP_KNA和356μL pH值为7.0的10mM PBS于37℃孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HP_KNA/SP_KNA修饰的AuNPs。

4.根据权利要求1所述的一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在卡那霉素(KNA)时，KNA与APT_KNA的特异性结合并使APT_KNA脱离SDB，紧接着CP_KNA则与AuNPs修饰的HP_KNA杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求2中CP_KNA/APT_KNA修饰的SDB 4μL、4μL不同浓度的KNA和2μL含0.1M NaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HP_KNA/SP_KNA修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。

5.根据权利要求1所述的一种牛奶中卡那霉素残留的比色检测方法，其特征是利用450nm处紫外吸光度的变化与卡那霉素浓度的关系，制定标准曲线，即可实现样品中卡那霉素含量的灵敏检测。将上述权利要求4中形成的SDB-AuNPs体系中加入0.5μL SAv-HRP于37℃下孵育1h，用200μL pH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL OPD-H₂O₂溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测450nm处紫外吸光度。检测一系列标准浓度的卡那霉素的紫外吸光度，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得卡那霉素的牛奶样品替代上述系列标准浓度的卡那霉素溶液，得到紫外吸光度通过标准曲线可计算出实际牛奶中卡那霉素的浓度。