[发明专利]一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用，属于分子生物学的技术领域。本发明结合易错PCR技术和DNA定点突变技术，对去掉了N端2‑7位六个氨基酸残基的野生型异亮氨酸双加氧酶IdoΔ6编码基因进行分子改造，得到了两个突变酶IdoΔ6^N126H和IdoΔ6^N126H/T130K，突变体酶与底物的亲和性为野生型的1.6～4.6倍，催化效率是野生型的2.4～2.8倍。利用突变体酶IdoΔ6^N126H/T130K合成4‑HIL产量提高了2.5倍，解决了在4‑HIL合成过程中，酶的催化效率低的问题，为利用该酶及其编码基因来生物合成4‑HIL创造好的条件。

技术领域

本发明涉及一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用，属于分子生物学的技术领域。

背景技术

定向进化属于非理性设计，是指在不了解酶分子相关的空间结构、催化机制的情况下，通过人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化的机制(随机突变、重组以及自然选择)，通过体外建立突变库，利用高通量定向筛选方法获得所需要的有价值的突变酶。近十年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变(site-directedmutagenesis)属于理性设计，是指对目的基因的指定位点进行碱基替换、饱和突变、缺失、或者插入，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。而将两种技术结合后有可能起到更好的效果。在通过定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后结合对其它重要位点进行定点突变，将有助于进一步改进酶分子的结构和功能，并了解这些位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。

异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase，简称IDO)以L-异亮氨酸(L-isoleucine，简称Ile)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称α-KG)和氧气为底物，催化Ile发生羟基化，生成4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，简称4-HIL)，同时将α-KG转变成琥珀酸。IDO仅存在于芽孢杆菌等少数物种中，但是它们的序列不尽相同。并且成熟的IDO酶的N端会去掉几个氨基酸残基，相对于未去除几个氨基酸残基的新生IDO酶，其稳定性和催化活性都有所提高。生物学中一般将IDO用于Ile的生物转化以合成4-HIL。4-HIL是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，在治理糖尿病及其并发症方面有潜在的应用价值。目前4-HIL的主要生产方法是生物转化法，IDO是4-HIL生物转化的关键酶，但是经研究发现IDO的热稳定性和pH稳定性不高，并且酶的催化效率低，这会使利用该酶生物合成4-HIL受到限制，导致4-HIL的产量偏低。为了近一步提高4-HIL的产量，因此需要对IDO酶进行改造，提高酶的活性和催化效率，为利用该酶及其编码基因来生物合成4-HIL创造好的条件。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种异亮氨酸双加氧酶突变体，含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。