[发明专利]肺炎克雷伯杆菌的IC-PCR检测引物组及其应用

说明书

本发明公开了肺炎克雷伯杆菌的IC‑PCR检测引物组及应用，其中检测引物包括上游引物F3、下游引物B3；本发明的IC‑PCR检测方法采用2条PCR特异性引物、肺炎克雷伯杆菌多克隆抗体、Protein A/G免疫沉淀磁珠等为主要成分构成的IC‑PCR反应液，建立了肺炎克雷伯杆菌PCR扩增快速检测方法，能够快速准确的检测肺炎克雷伯杆菌；该技术整合了抗体和PCR扩增技术的双重特异性，具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏且无需进行菌体的长时扩增培养、提取基因及质粒的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验、病人感染的病原菌等的现场快速检测，对于保障食品安全，及时、准确地指导药物使用具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于肺炎克雷伯杆菌检测的引物组、试剂盒。

背景技术

肺炎克雷伯杆菌为革兰氏阴性杆菌，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。在院内感染的败血症中，克雷伯杆菌以及绿脓杆菌和沙雷氏菌等均为重要病原菌，病死率较高是造成院内感染的主要病原菌之一。在我国，其感染率仅次于大肠杆菌，主要引起肺炎、败血症、尿路感染等疾病。

目前临床应用的肺炎克雷伯杆菌的检测方法包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，此方法培养时间长、工作量大、实验步骤繁琐，在很多突发事件中不能及时反映准确的数据。免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。常规 PCR 方法检测其灵敏度低，并且在检测前还需要进行菌体的富集，DNA的提取。免疫磁分离技术是将特异性抗体与一定大小的磁珠偶联，利用特异性抗体能与细胞表面抗原相结合的原理，将磁球与细胞结合，在外磁场的作用下，将磁球-细胞复合物从环境中分离出来，达到获取目标细胞的一项技术，但是单独使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。

发明内容

本发明目的在于提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的IC-PCR特异性引物组，它包括上游引物F3、下游引物B3，各引物序列如下：

F3: 5' - CCGATAGAGAACTCGAACTG -3'；（如SEO ID NO：1所示）

B3: 5' - TCTGATGCATTTTACCCTGAT -3'；（如SEO ID NO：2所示）。

本发明另一目的是提供一种肺炎克雷伯杆菌的IC-PCR检测试剂盒，其包括上述的肺炎克雷伯杆菌的IC-PCR检测引物组和结合有肺炎克雷伯杆菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠。

其中结合有肺炎克雷伯杆菌特异抗体的Protein A/G亲和磁珠是采用Protein A/G可以特异性的与抗体Fc段结合的原理制备的，具体参考Protein A/G免疫沉淀磁珠（美国Biotool，货号：B23202）产品说明书所述方法制得。

本发明试剂盒还包括常规PCR检测中所需的常规试剂，还包括DNA polymerase 1U、1.5 mM MgCl₂、 200 mM dNTP。

本发明将聚合酶链式反应（PCR）与免疫磁珠相结合，针对肺炎克雷伯杆菌重要的特异性基因ureR_1基因设计一套引物，优化反应条件，建立肺炎克雷伯杆菌IC-PCR检测技术。

本发明另一目的是提供了一种肺炎克雷伯杆菌检测的方法，利用Protein A/G免疫沉淀磁珠与肺炎克雷伯杆菌的多克隆抗体偶联形成免疫磁珠去捕捉样品中的肺炎克雷伯杆菌，然后通过直接裂解法获得基因组，通过PCR扩增，确认是否存在有肺炎克雷伯杆菌扩增产物。