[发明专利]疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法

说明书

一种使用疏水作用层析清除重组人神经生长因子中前体的方法，其特征是，在洗脱前增加清洗步骤，使用阶段电导及有机溶剂降低的清洗液进行清洗，使前体分子变异体的清除得以实现。

技术领域：

本发明涉及蛋白质纯化，具体涉及一种疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法。

背景技术：

基因工程表达的在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产的人神经生长因子(以下亦称为rhNGF)中含有多种杂质，不能直接应用，需要进行纯化才能使用。

现有技术的层析方法虽然能够除去rhNGF中的许多过程相关杂质(如宿主细胞蛋白及核酸)，但是很难除去作为产品相关杂质的rhNGF前体，其中前体是主要的变异体种类。因为这些变异体通常与成熟rhNGF一同产生，其中前体变异体由于含rhNGF序列,与rhNGF产品理化性质相近，并且由于加工程度的不同导致不同分子量前体的产生，增加了纯化的复杂性，使得rhNGF大规模纯化比较困难。

重组人神经生长因子在体内以前体形式合成，包括信号肽、前导肽和成熟rhNGF。其中前导肽中有两部分保守区域为前体表达、酶解形成具有生物活性的蛋白以及成熟rhNGF的分泌所必需，且其还有助于蛋白的正确折叠。前体经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟rhNGF。由于弗林蛋白酶或激素酶原转化酶加工不完全会产生完全或部分前体，统称为前体变异体。

虽然前体变异体与rhNGF产品性质相近，但通过分析技术及前体本身性质可以确定前体变异体与rhNGF存在的差异有：分子量(前体分子量大于rhNGF)、电荷(rhNGF等电点小于前体变异体)、疏水性(前体变异体由于含糖基化修饰疏水性弱于rhNGF)，这些细微的差异通常需要更低粒径的层析材料才能够分辨出来。

目前，对rhNGF进行纯化的报道有：

专利CN102702341A采用阳离子交换及分子筛(Superdex 75)两步方法制备了纯度大于98％的rhNGF，虽然猜测分子筛(Superdex 75)用以清除前体变异体，但该专利并未提及，且分子筛要求样品高度浓缩，上样量只能在柱体积1％-4％之间，树脂本身也较贵，规模化工业生产中不太适用。

专利CN1268639C采用疏水作用层析(优选苯基)用以去除前体，该方法采用了线性梯度的洗脱方式。

专利CN106478801A采用阳离子交换及疏水层析(优选苯基)两步方法制备的纯度大于99％的rhNGF，该方法疏水作用层析同样采用了线性梯度的洗脱方式。线性梯度洗脱方式通常需要双泵层析系统，对设备要求较高，不利于大规模工业生产。

以上这些方法均未使用疏水作用层析分离前体与成熟rhNGF，更没有采用阶段动态清洗的方式在层析之前清除前体变异体。

发明内容

本发明的目的是提供清除重组人神经生长因子中前体的方法。

本发明分析了rhNGF及其前体的理化性质。由于NGF前体中含有糖基化修饰，而成熟rhNGF不含糖基化修饰。前体由于存在糖链，比成熟rhNGF疏水性更弱。本发明利用该性质，使用疏水作用层析分离前体与成熟rhNGF，并使用疏水作用层析进行阶段清洗以清除前体变异体。而且本发明采用动态清洗的方式，提高了纯化rhNGF的效率。具体操作方法如下：

一种清除重组人神经生长因子中前体的方法，其特征是：

1)原料预处理：将CHO细胞培养物先经过一次或多次柱层析，初步纯化，得到待层析的原料；

2)原料清洗：将步骤1)所得物质加载于疏水层析柱中，用清洗缓冲液清洗，弃去含有前体的流出液；

3)用洗脱缓冲液对进行了步骤2)的层析柱进行洗脱，得到重组人神经生长因子纯品；