[发明专利]葡萄霜霉病菌离体保存方法

说明书

本发明公开一种霜霉病菌离体保存方法，是将葡萄霜霉病菌包埋于琼脂粉中，然后在‑80℃条件下进行保存，保存90d后回接葡萄健康叶片仍有致病性，还包括葡萄霜霉病菌的具体的保存处理方法及条件、保存后孢子囊致病性的测定等过程。本发明的方法是一种理想的、简单有效的保存方法。

技术领域

本发明涉及病菌离体保存领域，尤其涉及一种葡萄霜霉病菌离体保存方法。

背景技术

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni)属鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉菌目，霜霉科，单轴霉属。该病原菌为二倍体活体营养性专性寄生菌。无性阶段的孢子囊为其繁殖体。有性阶段产生卵孢子。

由于葡萄霜霉病菌是一种寄生性细菌，迄今为止在人工培养基上不能进行培养和保存，这给在不同时期、不同地点下研究该病菌带来很大困扰。目前国内外有关专性寄生菌离体保存的报道很多。如Gill和Davidson报道，野豌豆霉病菌的孢子囊用保护剂进行处理后在-80℃中可保存一年，回接感病品种的叶片后，发病面积百分率仍可达到50％以上；Gulya等报道，向日葵等霜霉病菌的孢子囊可在液氮中保存4年以上，这种方法同样也适用于P.parasitica和Pseudoperonospora Cubensis孢子囊的保存；Bromfield和Schmitt证明，烟草霜霉病菌的孢子囊用DMSO作为保护剂处理后，能在-180℃液氮中储存25个月后，仍然对宿主有致病性；郝勇娟报道，古巴假霜霉菌的孢子囊在-30℃保存40d以内均浸染成功，超过50d失去浸染力；张艳菊认为，黄瓜霜霉病菌孢子囊体外保存的最佳条件为10％DMSO和5％脱脂奶混合液预先-20℃冷冻24h，然后置于-70℃冰箱，孢子囊可保存12个月后仍具有较高的致病性；杜兴兰等人报道，5％DMSO作为保护剂在-76℃保存葡萄霜霉菌240d以上，而使用25％甘油作为保护剂在-76℃保存5d后，活化后在寄主上回接，发病面积仅为4％，保存效果较差。

上述常用的孢子囊保护剂有二甲基亚砜和液氮等。二甲基亚砜存在一定的毒性作用，高挥发浓度可能导致头痛和晕眩，能够灼伤皮肤使皮肤有刺痛感；液氮是一种使人窒息的气体，低温会对人造成冻伤，不可与皮肤接触；所以上述保护剂虽然常用但是也有各自的缺点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种葡萄霜霉病菌离体保存方法，使用琼脂粉作为保护剂，实验室可就地取材，安全方便快捷。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种霜霉病菌离体保存方法，将离体的霜霉病菌包埋在琼脂粉中后置于低于-20℃的环境保存。

最优的，置于-80℃的环境保存。

最优的，所述离体的霜霉病菌获得的步骤为：采集生长良好且感染霜霉病的单斑病叶，冲洗掉病叶表面杂物和原有的霜霉病菌霉层，然后将病叶置于铺有湿润纱布或滤纸的容器内，叶片背面朝上，用浸湿的棉花包裹叶柄，用滤纸吸干病叶表面残留的水珠，保鲜膜封住容器开口，蒙上黑布置于室温条件下保湿培养，待到病叶上生长出新的白色霜霉层后，用消毒后的剪刀将带有病斑的病叶剪下，得到离体的霜霉病菌。

最优的，所述冲洗掉表面残留的霜霉病菌霉层过程使用的是无菌蒸馏水；所述纱布、滤纸、容器、棉花均经过消毒处理，达到无菌状态；所述蒙上黑布置于室温条件下保湿培养过程是置于20℃±2℃，湿度90％以上，黑暗的条件下保湿培养24～36h。

最优的，所述保存时间不超过120天；且最佳保存时间不超过90天。

一种葡萄霜霉病菌离体保存方法，将离体的葡萄霜霉病菌包埋在琼脂粉中后置于低于-20℃的环境保存。

最优的，置于-80℃的环境保存。