[发明专利]一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达中的应用

说明书

本发明公开了一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达中的应用。CYLD敲除CHO细胞株的构建方法，具体为：将敲除载体导入到CHO细胞后进行筛选，获得由该敲除质粒介导的CYLD表达缺失的细胞株。敲除细胞中核苷酸序列SEQ ID NO:1可以替换为SEQ ID NO:2、NO:3、NO:4、NO:5或NO:6；被转染的细胞可以是CHO‑K1细胞或者稳定表达某种抗体的CHO细胞。本发明对提高治疗性重组蛋白的表达产量具有重要的应用价值。

技术领域

本发明主要涉及一种CHO改造细胞株的构建及其在治疗性重组蛋白表达过程中的应用。

背景技术

近年来，治疗性抗体在临床恶性肿瘤、自身免疫病以及快速传染病等疾病的防治上取得了显著的疗效。同时也促进了抗体行业的整体发展，全球抗体行业总产值逐年攀升，据统计2016年单克隆抗体全球销售额近700亿美元，并以10％左右的速度在增加。而我国抗体行业目前仍以仿制为主，在抗体品种上缺乏有效创新。同时，整体产能严重不足，文献报道我国抗体行业平均产量在1g/L左右，显著低于国外的4g/L的水平。因此，有效提高抗体产量成为当务之急。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是抗体行业最常用的宿主细胞。CHO细胞具有良好的可塑性和生长特性，能够在无血清的培养基中进行高密度悬浮培养。然而随着反应器容积的增大，保持长时间高密度生长及持续生产抗体的能力成为进一步提高抗体产量的关键因素。在代谢压力、营养限制以及剪切压力等情况下能够介导CHO细胞发生凋亡，因此控制凋亡成为有效提高产量的一种方法。主要方法有：1、优化培养过程和培养基优化；2、CHO细胞工程，过表达抗凋亡基因或者抑制促凋亡基因来实现CHO凋亡控制。单独改变抗凋亡或促凋亡基因仍然存在弊端，例如CHO细胞生长速度减缓，细胞株筛选过程受阻；产抗过程中细胞有丝分裂减缓，无法达到希望的细胞密度。因此，筛选多功能基因并构建相应的细胞株成为新的理想途径。

肿瘤抑制因子CYLD(Cylindromatosis，头帕肿瘤综合征蛋白)是一种去泛素化酶。在多种肿瘤，如圆柱瘤、T细胞白血病、结肠癌、肝癌以及肺癌等癌症中发生缺失或者突变，表明CYLD的异常与肿瘤的发生发展密切相关。同时，CYLD还是一种重要的免疫调节基因，广泛参与先天性免疫应答以及炎症反应过程。机制研究表明CYLD主要通过负调控NF-κB、JNK、Wnt等信号通路发挥功能。此外，CYLD还可以和细胞骨架蛋白相互作用来调节细胞增殖。抑制CYLD可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，并广泛影响多种信号通路来调控多种生理功能。因此，CYLD成为了一种多功能基因。

近年来，基因编辑技术发展迅猛，CRISPR-Cas9核酸酶系统具有更加高效、快速的技术特点，已经被广泛应用于真核细胞的基因组编辑。该技术利用特异性的向导RNA引导Cas9核酸酶在特定位置进行切割，形成DNA双链断裂(DSB)，随后利用非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的修复方式对靶基因区域进行编辑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达过程中的应用，提高治疗性重组蛋白产量的方法。

一方面，本发明提供了一种基因敲除CHO细胞株的构建方法，具体方法：

根据CRISPR-Cas9技术要求和序列同源性比对分析，筛选并设计特异性靶向CYLD外显子的sgRNA序列：5’-GCTGTACGGACGGAACTTTC-3’。构建带有这种序列的载体，导入到CHO细胞后进行筛选，获得由该敲除质粒介导的CYLD表达缺失的细胞株。

其中，敲除细胞中核苷酸序列SEQ ID NO:1可以替换为SEQ ID NO:2、NO:3、NO:4、NO:5或NO:6；被转染的细胞可以是CHO-K1细胞或者稳定表达某种抗体的CHO细胞。

另一方面，本发明提高了如上所述方法构建的基因敲除CHO细胞株在治疗性重组蛋白表达中的应用；在该平台细胞中瞬时转染编码质粒后可以提高相应重组蛋白的产量。