[发明专利]一种提高大肠杆菌合成的聚（3-羟基丁酸-co-乳酸）中乳酸组分含量的方法

说明书

本发明提供了一种提高大肠杆菌合成的聚(3‑羟基丁酸‑co‑乳酸)中乳酸组分含量的方法，在重组大肠杆菌E.coli MG‑01的基础上，敲除黄素异戊烯基转移酶基因ubiX，和/或敲除D‑乳酸脱氢酶基因dld，和/或替换表达丙酰辅酶A转移酶pct_cp的启动子为组成型的ldhA启动子。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在有氧条件下，能提高大肠杆菌中合成的聚(3‑羟基丁酸‑co‑乳酸)中乳酸组分的摩尔百分比。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，更具体地讲，涉及精细调控微生物合成聚酯中单体组分的方法及应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种生物合成的高分子线性聚酯，可作为细胞内能源和碳源的储存物质。多以疏水型颗粒形式存在，其分子量一般为几万至几百万道尔顿不等(Biotechnol.Bioeng,1996,54:450-472)。PHA由于其卓越的材料学性质，如生物再生性、生物可降解性、热塑性和生物相容性受到广泛关注 (Metab Eng,2016,35:1-8)。

聚羟基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]，是近年来PHA家族的新成员，聚合单体来源于3-羟基丁酸和乳酸。共聚物由于其构成单元与成分的不同，表现不同的热力学性质和机械性质，因此有着广泛的应用。P(3HB-co-LA)有着均聚物共有的优点如类似PLA的玻璃化温度和P(3HB)的良好的生物降解能力 (Biomacromolecules,2009,10:677-681)。

Taguchi等(Proceedings of the National Academy of Sciences,2008, 105:17323-17325)通过改造聚羟基脂肪酸合成酶构造了可生产乳酰辅酶A的大肠杆菌，首次成功合成聚羟基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]。其中，PhaC1(STQK) 基因来源于Pseudomonassp.61-3，并包含Ser325Thr/Gln481Lys突变；β-酮基硫解酶(PhaA)、NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)来源于Ralstonia eutropha；丙酰辅酶A转移酶(PCT)则来源于Megasphaera elsdenii。在首次成功合成的聚羟基丁酸乳酸酯中，乳酸组分的摩尔百分比较少，只达到6％。 Yamada(Biomacromolecules,2009,10:677-681)等，将发酵条件改为厌氧，将乳酸组分的摩尔百分比提高到47％，但聚合物含量仅有2wt％。 Yang(BiotechnologyBioengineering,2010,105:150-160)等主要从基因改造的方向入手，在添加3HB和葡萄糖的情况下，通过易错PCR和饱和突变增加pct_cp对乳酸的底物特异性，提高phaC1_PS6-19对2-羟基丙酰辅酶A的底物特异性，可生产乳酸组分的摩尔百分比达49％，聚合物含量为53.5wt％的P(3HB-co-LA)。2013年Nduko等(Metabolic Engineering,2013,15:159-166)利用进一步优化的PHA聚合酶，并选择木糖为碳源,生产出乳酸组分的摩尔百分比达60％，聚合物含量达70wt％的共聚物。

呼吸链是细胞能量代谢的重要途径，当呼吸链水平高的时候，细胞生产速率高，细胞中还原当量NADH积累小，但很多还原型产物都有商业利润，呼吸链的高水平不利于还原型产物的积累；当呼吸链水平低的时候，细胞产能低，生长缓慢(Metabolic Engineering,2015,28:159-168)。为了解决这一矛盾，我们选择了存在于大肠杆菌呼吸链中，作为电子传递系统中的递氢体的辅酶Q8，通过控制辅酶Q8的合成来有效控制细胞呼吸链水平从而控制细胞碳代谢分布。在这一发明中通过敲除辅酶Q8生产过程中的黄素异戊烯基转移酶(UbiX)来降低胞内辅酶Q8水平。在好氧发酵过程中，细胞利用葡萄糖生产的乳酸随辅酶Q8浓度的降低而增加，因此通过调节辅酶Q8的水平可以提高 P(3HB-co-LA)中乳酸组分的摩尔百分比。

发明内容