[发明专利]一种可视化检测转基因食品的方法

说明书

本发明公开了一种可视化检测转基因食品的方法，属于食品安全领域。本发明以转基因食品为检测对象，提取其基因组DNA，设计对转基因食品具有特异性识别功能的CaMV 35S特定核酸探针和相应的模板序列，在特异性CaMV 35S启动子存在的情况下，可以与其序列互补模板序列结合形成环状，在T4‑DNA连接酶及phi29聚合酶的作用下，引发滚环扩增反应，扩增产物中包含的G‑四链体结合氧化血红素形成DNA酶催化ABTS显色，可视化检测转基因食品。本发明实现了转基因食品中启动子CaMV 35S的可视化检测，具有操作简单、可视化检测等优点，适用于含CaMV 35S启动子基因的转基因大豆、玉米，番茄等转基因食品的检测。

技术领域

本发明涉及一种可视化检测转基因食品的方法的方法，属于食品安全领域。

背景技术

转基因生物由于其抗除草剂、抗虫、抗病毒等的抗性和高产量、高营养成分等特性在农业领域具有一定的优势。并且全球的转基因作物种植面积从1996年的1.7万顷增加到2015年的179.7万顷。大豆作为食品和饲料的重要蛋白质来源之一。随着发展，转基因大豆作为为一种主要的转基因食品，在减轻贫困及缓解饥饿问题方面起到了至关重要的作用。同时，转基因大豆的安全性及对环境和健康的影响仍存在争议。欧盟、韩国、日本和澳大利亚等许多国家需要对大豆进行分析，以确保严格遵守的标签规定。才能将其卖给消费者，根据标签规定，食品产品中转基因成分的阈值水平为0.9％-5％。

过去20年，检测转基因食品有很多种方法。主要有两方面，一种方法是基于外源基因表达蛋白的检测，包括分子印迹，酶联免疫和试纸条法等。这些基于蛋白质检测的方法的缺点是耗时，有的需要用检测蛋白的专用仪器；并且在一些深加工食品中，一些蛋白质可能在加工制造过程中被破坏，导致检测效果差。另一种方法是基于基因的稳定性进行的基因的检测。目前常被用在检测转基因生物的基因有花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)、5-烯丙基酸盐3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)和终止子胭脂碱合酶基因(NOS)等。这些基因检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)结合琼脂糖凝胶电泳，实时荧光PCR，表面离子共振等。然而，这些方法也有一些缺点，如耗时，仪器昂贵，操作较为复杂。因此，研究简单、快速和灵敏的检测转基因大豆分析方法十分有意义。

滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)是近几年发展起来的一种等温条件下的DNA复制技术，在恒温条件下，以短寡核苷酸链为引物，线性单链DNA序列形成环状模板，使用具有链置换作用的DNA聚合酶使引物扩增生成含有许多互补于环状模板的串联重复长链DNA序。扩增产物主要通过凝胶电泳、荧光探针、量子点和偶联纳米粒子等方式检测。因操作简便、特异性强、扩增高效、产物稳定，该技术受到越来越多的关注，被作为高度通用的DNA扩增工具，广泛地应用于核酸序列、蛋白质和小分子等超灵敏检测中。

在RCA方法中，能形成环状的RCA模板可以与目的基因结合，在聚合酶的反应下循环扩增，形成长链的核苷酸产物。对PCR而言，其主要局限是必须要进行热循环步骤，并且仪器费用昂贵。RCA方法作为生物研究和诊断的基本方法已经成为PCR的替代方法。随着RCA技术的快速发展，RCA技术已不但用于扩增质粒、噬菌体DNA和病毒环形核酸分子等环状核酸模板，而且也可利用随机引物和指数RCA扩增原理来实现全基因组扩增。至今为止，多重替换扩增和限制性连接环化RCA已被报道用于全基因组扩增。前者主要利用phi29聚合酶在恒温条件(30℃)下对少于十个的人类细胞进行精密准确的全基因组扩增，2～3h后反应达到平衡。该技术也可用于人类全血中的基因组扩增，且无需纯化DNA。后者则是先通过限制性内切酶催化作用得到短链基因组DNA，再进行环化和连接生成环状DNA模板，引物开始触发RCA反应。