[发明专利]高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用

说明书

本发明公开了一种高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用，涉及基因工程技术领域。本发明以pcDNA3.1(‑)质粒为骨架，将cumate‑cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET‑28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列插入cumate‑cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN‑001。本发明的重组质粒DN‑001具有最经济、最方便和高产量等优点，使得基因表达载体的重组省时、省力；可以适用于生产大剂量的重组蛋白；同时有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达，使得这一载体具有广泛的市场前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种通过基因工程方法改造的高拷贝高表达重组质粒，及该重组质粒在外源基因表达中的应用。

背景技术

原核生物基因表达系统是最经济、最方便和使用最广泛的重组基因表达系统，包括His标签重组蛋白的表达(现有文献：Rosano GL,Ceccarelli EA.Recombinant proteinexpression in Escherichia coli:advances and challenges.FrontMicrobiol.2014Apr 17；5:172；Wingfield PT.Overview of the purification ofrecombinant proteins.Curr Protoc Protein Sci.2015Apr 1；80:6.1.1-35有相关说明)。His标签由6个组氨酸组成，分子量小、免疫原性差、不改变蛋白质的空间结构及其溶解性；利用带镍离子的填料进行亲和纯化，方法简单、成本低、目标蛋白纯度高，是目前应用最广泛的融合表达亲和标签。pET和PQE系列质粒载体是目前最常用的His蛋白表达载体，目的基因被克隆到pET和PQE质粒载体上，受T7或T5强转录及翻译(可选择)信号控制；充分诱导时，细菌能高度地表达目的蛋白。然而，pET和PQE系列质粒表达系统存在三个明显的缺陷。其一，它们在大肠杆菌中的复制效率低，基因重组费时、成本高；其二，重组的目的蛋白易漏出表达，表达有毒蛋白时会抑制细菌生长甚至杀灭细菌。其三，诱导剂IPTG的高花费和潜在的毒性阻碍这一表达系统用于生产大剂量的重组蛋白。近年开发的另一原核生物表达系统---cumate诱导表达系统(现有文献：Choi YJ,Morel L,LeT,Bourque D,Bourget L,Groleau D,Massie B,Míguez CB.Novel,versatile,and tightly regulatedexpression system for Escherichia coli strains.Appl Environ Microbiol.2010，76(15):5058-66；Mullick A,Xu Y,Warren R,Koutroumanis M,Guilbault C,Broussau S,Malenfant F,Bourget L,Lamoureux L,Lo R,Caron AW,Pilotte A,Massie B.The cumategene-switch:a system for regulated expression in mammalian cells.BMCBiotechnol.2006，6:43有关原核生物表达系统---cumate诱导表达系统的说明)被认为优于pET和PQE系列质粒载体系统。这一系统采用结合cuo操纵子的CymR阻遏物进行调控，外源基因的表达依赖诱导剂cumate加入，由于小分子化合物Cumate水溶性好而且无毒，这一系统适用于生产大剂量的重组蛋白。然而，国内市场尚无相关的质粒载体。另外，我们测试发现依文献构建的载体有漏出表达。因此，借鉴cumate诱导系统构建新的高拷贝高表达且无漏出表达的质粒载体将会有极大的市场价值。

发明内容