[发明专利]一种蛋白质巯基化修饰检测的方法

说明书

本发明涉及蛋白质巯基化修饰检测检测领域。一种的蛋白质巯基化修饰检测的方法，将经过硫氢化钠溶液、MMTS溶液、Biotin‑HPDP溶液、HENS缓冲液顺序浸泡的固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜置于BSA封闭液中，按常规Western blot实验操作检测，一抗为Biotin抗体。本发明减少了蛋白质巯基化检测过程中所需的蛋白质用量，缩短检测时间，同时检测样品数增加（提高通量）。

技术领域

本发明涉及蛋白质巯基化修饰检测检测领域。

背景技术

蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。绝大部分蛋白质在细胞内合成之后需要经过翻译后修饰才能表现出生物活性。翻译后修饰影响蛋白质的活性、定位、折叠以及蛋白质相互作用，是调节蛋白质生物功能的重要方式。已报道的翻译后修饰达400多种，包括磷酸化、糖基化、乙酰基化、泛素化、羧基化及二硫键的配对等。

组成蛋白质的20种氨基酸，在蛋白质活性部位存在的概率不同，主要的五种活性位点氨基酸是His（0.36）、Cys（0.21）、Ser（0.13）、Lys（0.1）和Thr（0.1）；发生在Cys残基的修饰包括亚硝基化、棕榈酰化、异戊二烯化、磺酸化等，Cys残基之间通过形成二硫键影响蛋白质的结构；通过与金属离子的结合调节蛋白质的功能。

研究发现气体信号分子硫化氢通过对蛋白质Cys残基的巯基化修饰（由-SH修饰为-S-SH）调节蛋白质活性和功能，以此参与动植物体的多种生理功能。生物素开关法是蛋白质Cys残基巯基化修饰水平检测的方法之一，将提取的植/动物蛋白或纯化的原核表达蛋白在体外进行硫氢化钠处理，经丙酮沉淀和蛋白溶解后利用MMTS对非巯基化修饰的自由Cys的-SH残基进行封闭，再经丙酮沉淀后蛋白溶解后，利用Biotin-HPDP对巯基化修饰后的Cys残基（-S-SH）进行生物素标记，之后SDS-PAGE电泳并利用生物素抗体进行常规的western blot检测，而本专利对该实验过程进行改进，将蛋白样品固定在硝酸纤维素膜上后，进行巯基化修饰，封闭和生物素标记，之后进行检测，减少了蛋白质巯基化检测过程中所需的蛋白质用量，缩短检测时间，同时检测样品数增加（提高通量）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何对蛋白进行硫化氢巯基化修饰，减少了蛋白质硫化氢巯基化检测过程中所需的蛋白质用量，缩短检测时间，同时提高检测精度。

本发明所采用的技术方案是：一种蛋白质巯基化修饰检测的方法，将经过硫氢化钠溶液、MMTS溶液、Biotin-HPDP溶液、HENS缓冲液顺序浸泡的固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜置于BSA封闭液中，按常规Western blot实验操作检测，一抗为Biotin抗体。

作为一种优选方式：固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜制作过程为，将硝酸纤维素膜于TBST缓冲液中浸泡20min，进行活化，然后将活化的硝酸纤维素膜室温晾干，在晾干的活化的硝酸纤维素膜上滴加蛋白样品。

作为一种优选方式：蛋白样品为经大肠杆菌原核表达的植物蛋白，取0.5~1.5 μg植物蛋白滴5个圆斑。

作为一种优选方式：硫氢化钠溶液浸泡是指将固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜置于50-100 μmol/L的NaSH水溶液中，避光条件下4℃反应20min。

作为一种优选方式：MMTS溶液浸泡是指将经过硫氢化钠溶液浸泡的固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜置于10mM的MMTS溶液中，避光条件下50℃反应25min，期间每2min混匀一次，利用MMTS封闭蛋白质Cys残基的自由巯基-SH。

作为一种优选方式：Biotin-HPDP溶液浸泡是指将经过硫氢化钠溶液、MMTS溶液顺序浸泡的固定有蛋白样品的活化的硝酸纤维素膜置于2mM 的Biotin-HPDP溶液中，室温反应3h。