[发明专利]一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法

说明书

一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法，该方法包括外植体消毒处理、腋芽初诱导培养、丛生芽继代增殖培养和生根培养4个技术环节，方法以刚萌发15～20天的半木质化带芽茎段为外植体，依次通过抗氧化剂Vc和柠檬酸混合蒸馏水溶液、高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡、消毒的方法将外植体褐变污染率控制在10%以下；最后通过在初诱导和继代增殖培养二阶段的培养基中添加活性炭和聚乙烯吡咯烷酮来吸附有害物质和抑制酚类物质分解，保障丛生芽诱导分化率在95%以上，增值系数9.0以上。在生根培养基中添加蛋白胨，生根率达100%，平均每株分化根系5～8根。本方法简便易行，为该猕猴桃良种种苗工厂化培育技术体系集成提供依据。

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，进一步来说，涉及“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法。

背景技术

猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本果树,其果实营养丰富,其维生素含量居各种水果之首；猕猴桃全株均可入药，其根、果实等部位提取物具有抗肿瘤、抗氧化等作用。“红阳”猕猴桃是1989年由四川省苍溪县农业局从中华猕猴桃实生苗中选育出的优系，因其鲜果横剖面沿果心有紫红色线条，呈放射状分布，似太阳光芒四射，故称“红阳猕猴桃”，该品种果实短圆柱形，肉质鲜嫩，果心小，果味浓，品质极佳，总糖含量为13.45％，高出世界流行品种“海沃德”近5％，已成为近10年来国内种植推广面积较大的品种。当前嫁接苗细菌性溃疡病已严重导致产量和品质下降，只有采用组培育苗方法，才能解决该产业致命性的问题。

猕猴桃属植物组培研究报道较多。谢志兵等（2003）认为把组培苗直接接种在吲哚丁酸(IBA)浓度为0.7mg·L^-1的生根培养基中，存活率高且诱导生根效果最好，单株生根数量及根总长均高于其它浓度。郭韩玲等（2008）报道了早金猕猴桃的组培育苗方法，认为在MS培养基中添加6.0mg·L^-16-苄氨基嘌呤(6-BA)和0.4mg·L^-1 萘乙酸(NAA)后增殖培养最好，在1/2培养基中添加0.4mg·L^-1 IBA后生根率最高。田宏观等对“米良1号”猕猴桃的组培育苗技术研究后发现，带芽茎段在MS+1.0 mg·L^-1玉米素(ZT)上诱导培养最好，外植体可直接分化出丛生芽；成熟茎段出芽早，幼嫩茎段出芽迟，有芽茎段出芽早，无芽茎段出芽迟；MS+1.0 mg·L^-1 IBA有较好的诱导生根作用。吕海燕等（2015）对狗枣猕猴桃的组培育苗技术研究也发现，幼嫩带芽茎段虽不能再生形成愈伤组织，但其腋芽能直接萌发，并迅速成苗；带芽茎段最佳取样时间为春季未木质化的嫩枝；腋芽一步成苗培养基配方为：MS＋1.25mg·L^-1 6-BA＋0.25 mg·L^-1 NAA，腋芽萌发率达92.9%，继代周期为30-40d，增值系数可达5.33；最佳生根培养基为：1/2MS＋0.2mg·L^-1NAA，生根率100％，平均根数12.5条。张太奎等（2017）报道了引种品种“Hort16A”猕猴桃离体再生技术，结果表明:外植体在MS+0.05mg·L^-1 NAA+0.3mg·L^-1 ZT中培养20d后诱导愈伤组织效果最好，诱导率达97.78%；继续培养14d后，不定芽分化率达84.44%；不定芽在MS+1.5mg·L^-1ZT中培养30d后，增殖倍数达3.67；无菌苗在1/2MS+0.7mg·L^-1 6-BA+0.1g·L^-1活性炭(AC)培养基中生根最佳，生根率98.9%，平均每株生根数7.67根。蔡冬元（2014）报道了长叶猕猴桃的初诱导培养方法，认为:在MS培养基中添加1.0 mg·L^-1 6-BA和0.1mg·L^-1NAA后有利于带芽茎段初诱导培养，添加0.5 mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA后有利于叶片初诱导培养。吴延军（CN101647393A）公开了毛花猕猴桃的组织培养方法，认为半木质化茎段为最佳外植体，最佳诱导培养基为MS+2.0～5.0 mg·L^-1 6-BA+0.1～0.5 mg·L^-1NAA，最佳增殖培养基为MS+1.0～5.0mg·L^-1 6-BA+0.1～0.5mg·L^-1 NAA或0.1～0.5 mg·L^-1IBA，生根培养基为MS或1/2MS+1.0g·L^-1 AC+0.1～0.5mg·L^-1 NAA或0.05～1.0 mg·L^-1 IBA。赵兰在中国发明专利申请CN104012410A、CN104012408A、CN104012412A中公开了猕猴桃基生枝的初诱导、继代增殖和生根繁殖的方法，认为在改良后的MS培养基上添加1.0～2.0mg·L^-16-BA、1.0～1.5mg·L^-1 激动素(KT)和0.1～0.3mg·L^-1NAA后继代增殖效果最好。软枣猕猴桃组培育苗技术研究报道较多，以茎段、叶块、叶柄、腋芽、茎尖和未成熟胚等作为外植体进行组织培养均有成功报道；在培养基的选择上，主要使用MS培养基，也有学者使用1/2MS培养基；在激素使用方面，多使用细胞分裂素6-BA、ZT、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和生长素IBA、NAA，根据外植体、培养阶段的不同，选择一种或者几种激素组合及相应的浓度；增殖系数5.33～5.8；王振兴（CN105359976A）公开了在非离体条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新梢的方法，通过机械损伤茎段产生愈伤组织，然后用4.5mg·L^-1噻苯隆TDZ 溶液浸湿脱脂棉，用脱脂棉覆盖愈伤组织后，诱导分化再生新梢。