[发明专利]一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法

说明书

本发明涉及蛋白质提取技术领域，特别涉及一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，该方法包括细胞裂解、蛋白质样品制备、蛋白质纯化和肽段回收等步骤，采用非接触式超声破碎样品结合磁珠进行蛋白质富集的方法，大大减少了样品使用量并提高了蛋白质的提取效率，该技术操作实用性强，且易普及，为蛋白质组学技术用于微量或珍贵样品的研究提供了行之有效的样品处理方法，使之能够满足蛋白质组学研究所需的样品条件该发明的样本处理方法解决了目前微量样品无法满足蛋白质组学研究所需样本量的瓶颈问题，也为单细胞蛋白质组学分析提供了可行性方案，是一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法。

【技术领域】

本发明涉及蛋白质提取技术领域，特别涉及一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法。

【背景技术】

中国水牛均为沼泽型，原为南部地区的役畜，后来随着农业机械化，水牛乳肉价值逐渐取代了其役用价值，但是中国水牛繁殖效率低，又使其乳肉价值得不到很好的开发，而生殖细胞成熟质量是影响水牛繁殖率的主要原因之一，这种复杂性主要表现在转录、翻译和翻译后修饰及调控网络上。蛋白质是生命功能的执行者，采用高通量的蛋白质组学技术可大规模发现蛋白质的表达和翻译后修饰，有助于从整体上揭示生殖细胞发育的蛋白质调控网络，筛选和鉴定关键基因或生物标志物，所以有必要对水牛的卵母细胞及早期胚胎的蛋白质组进行研究，以期为提高水牛繁殖能力奠定基础。

2014年，Daniela R.Deutsch等人利用1600个卵母细胞或者早期胚胎共鉴定到1072种蛋白质；2015年，陈富美等人利用1000个GV期和MII期的水牛卵母细胞鉴定到574种蛋白质；2016年，陈凌声等人从522个GV期和545个MII期水牛卵母细胞中分别鉴定到647和570种蛋白质，水牛卵母细胞及早期胚胎材料极为珍贵，传统的蛋白质组学方法对细胞样品上样量要求需要上千个细胞，而常规的蛋白质分离纯化方法不能高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎的微量蛋白质，给水牛的繁殖研究带来了一定的困难，所以迫切需要找出一种可高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎微量蛋白质的方法，能有效的提高蛋白质提取效率，满足分析所需上样量的需求，从而实现水牛微量生物样品甚至单个细胞蛋白的蛋白质组学研究。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种可高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎微量蛋白质的方法，能有效的提高蛋白质提取效率，满足分析所需上样量的需求，从而实现水牛微量生物样品甚至单个细胞蛋白的蛋白质组学研究。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，所述方法为：先将磁珠进行预处理得到均质磁珠溶液，然后富集水牛细胞并将其放在冰上进行第一次裂解；向第一次裂解后的水牛细胞加入均质磁珠溶液和三氟代乙醇的混合物并进行第二次裂解；然后对第二次裂解液进行蛋白质纯化、肽段回收得到富集后的水牛细胞蛋白质；

进一步的，所述水牛细胞为水牛卵母细胞或水牛早期胚胎细胞；所述水牛早期胚胎细胞包括孤雌激活胚胎细胞和体外受精胚胎细胞：

所述水牛卵母细胞的富集方法包括以下步骤：

(1)预处理卵巢：剪去水牛卵巢多余组织，用39℃的双抗生理盐水清洗2-3遍，清洗完后将卵巢置于39℃左右的双抗生理盐水中，并在39℃的恒温水浴条件下保温完成水牛卵巢预处理；

(2)用含有1-2mL洗卵液的10mL注射器抽取步骤(1)预处理后卵巢表面的卵泡，将抽取的卵泡液连同洗卵液一起放入60mm的捡卵皿中，在体式显微镜下挑选卵丘卵母细胞复合体，剔除裸卵和蜘蛛网状卵；

(3)将步骤(2)挑选的卵丘卵母细胞复合体依次用洗卵液和成熟液各清洗2-3遍，然后置于成熟液中并放在39℃含有体积百分数为5％二氧化碳的培养箱中培养22-24h后，用 200μL的移液器吹打成熟后的卵母细胞至周围无颗粒细胞，然后向卵母细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，完成水牛卵母细胞的富集；