[发明专利]一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法

权利要求书

1.一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，其特征在于，所述方法为：先将磁珠进行预处理得到均质磁珠溶液，然后富集水牛细胞并将其放在冰上进行第一次裂解；向第一次裂解后的水牛细胞加入均质磁珠溶液和三氟代乙醇的混合物并进行第二次裂解；然后对第二次裂解液进行蛋白质纯化、肽段回收得到富集后的水牛细胞蛋白质；

所述磁珠进行预处理的方法包括如下步骤：

①将保存在4℃下的亲水性磁珠A和疏水性磁珠B取出分别放置在室温下摇匀；

②分别取20μl步骤①的亲水性磁珠A、疏水性磁珠B和160μl超纯水混合，并置于PCR管内混匀；

③将步骤②含有磁珠的PCR管置于磁力架上静置，待磁珠吸附至管底后去掉上清；

④将步骤③的PCR管从磁力架上取下，加入超纯水200μl混匀，重新放置磁力架上静置，待磁珠吸附至管底后去掉上清，此步骤重复3次；

⑤向步骤④的PCR管中加入超纯水100μl混匀，4℃长期保存；

所述第一次裂解的方法为：取富集的水牛细胞1-25个，向水牛细胞中加入20μl的裂解液并放置在温度为-2℃～0℃的冰上裂解10min；

所述第二次裂解的方法包括如下步骤：

A、将第一次裂解后的溶液：预处理磁珠：三氟代乙醇按照体积比为5:1:5进行混合；

B、将步骤A的混合物放入冰浴中进行超声处理，所述超声处理的处理方式为间隔超声处理，按照“超声5s-间隔30s-超声5s”的处理方式进行循环，超声处理的总时长为15min；超声处理后进行2s的离心处理得到第二次裂解液；

C、向步骤B离心处理后的第二次裂解液中加入质量百分数为0.1％的甲酸0.75μl,混匀；

D、将步骤C的混合液放入PCR仪中反应，反应条件为：95℃6min，0℃50s，45℃30min；

E、向步骤D反应液中加入400mmol的吲哚-3-乙酸5μl，在室温下孵育30min；

F、步骤E孵育结束后，向反应液中加入200mmol的二硫苏糖醇5μl，终止反应；

所述蛋白质纯化的方法包括如下步骤：

步骤1：取第二次裂解后得到的混合液54.75μl与质量百分数为1％的甲酸溶液10μl均匀混合；

步骤2：向步骤1的混合液中加入乙腈溶液，使乙腈最终的质量浓度达到50％；

步骤3：将步骤2的混合液在室温下静置8min，然后再放置在磁力架上静置2min，待磁珠吸附至管底，去掉上清；

步骤4：在磁力架上，用200μl体积百分数为70％的乙醇，清洗磁珠两次，最后用200μl的乙腈清洗磁珠一次，开盖室温干燥至磁珠龟裂；

步骤5：向步骤4干燥后的磁珠加入酶解溶液进行酶解，保证磁珠包含在酶解溶液中，无需混匀，在37℃条件下静置14h-24h；

所述肽段回收的方法包括如下步骤：

步骤A：重悬酶解后的磁珠，加入乙腈溶液在PCR管中混匀，使其终浓度达到95％；在室温下静置8min；

步骤B：将步骤A静置后的PCR管磁珠混合液置于磁力架上，待磁珠吸附至管底，去掉上清；用200μl乙腈清洗磁珠一次，开盖室温干燥至磁珠龟裂；

步骤C：向步骤B的PCR管内加入质量百分数为2％的二甲基亚砜溶液10μl对磁珠进行复溶，保证磁珠包含在二甲基亚砜溶液中并进行超声处理；所述超声处理的处理方式为间隔超声处理，按照“超声5s-间隔30s-超声5s”的处理方式进行循环，超声处理的总时长为1min；超声处理后进行2s的离心处理；

步骤D：将步骤C离心处理后的PCR管置于磁力架上，室温静置2min，待磁珠吸附至管底，回收上清液至新的PCR管，得到回收液I；

步骤E：将含有步骤D回收液I的PCR管再置于磁力架上，进行第二次回收，确保上清内不含有磁珠，得到回收液II，将回收液II放入1μl质量百分浓度为1％甲酸溶液中在-20℃条件下保存，完成肽段回收过程；

所述水牛细胞为水牛卵母细胞或水牛早期胚胎细胞；所述水牛早期胚胎细胞包括孤雌激活胚胎细胞和体外受精胚胎细胞：

所述水牛卵母细胞的富集方法包括以下步骤：

(1)预处理卵巢：剪去水牛卵巢多余组织，用39℃的双抗生理盐水清洗2-3遍，清洗完后将卵巢置于39℃左右的双抗生理盐水中，并在39℃的恒温水浴条件下保温完成水牛卵巢预处理；

(2)用含有1-2mL洗卵液的10mL注射器抽取步骤(1)预处理后卵巢表面的卵泡，将抽取的卵泡液连同洗卵液一起放入60mm的捡卵皿中，在体式显微镜下挑选卵丘卵母细胞复合体，剔除裸卵和蜘蛛网状卵；

(3)将步骤(2)挑选的卵丘卵母细胞复合体依次用洗卵液和成熟液各清洗2-3遍，然后置于成熟液中并放在39℃含有体积百分数为5％二氧化碳的培养箱中培养22-24h后，用200μL的移液器吹打成熟后的卵母细胞至周围无颗粒细胞，然后向卵母细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，完成水牛卵母细胞的富集；

所述孤雌激活胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在5mol/L的离子霉素中处理5min，然后用2mmol/L的6-DMAP溶液处理4-6h，将处理好的卵母细胞在培养液中清洗2-3遍，移入培养液滴中进行培养，收集分裂至2-细胞期的早期胚胎，然后向2-细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到孤雌激活胚胎细胞；所述培养的培养时间为24h；

所述体外受精胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在受精液中洗2-3遍，移入含有40ul受精液的滴中，每滴含有15-20个MII期卵母细胞，每滴加入处理后的精液15μl，在培养箱中受精6-8h，吹掉死精子，将受精后的卵母细胞移入单层颗粒细胞中共同培养12h后，收集分裂至2-细胞的早期胚胎，然后向2-细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到体外受精胚胎细胞；

所述洗卵液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO₃溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、肝素钠0.004μg/ml、新生牛血清3％、青霉素600mg/L、链霉素100mg/L，余量为水，PH为7.2-7.4；

所述成熟液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO₃溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、质量百分数为10％的胎牛血清、乳酸钠0.026％、卵泡刺激素0.5μg/ml、促黄体生成素5μg/ml，余量为水，PH为7.2-7.4；

所述受精液含有如下成分：质量百分数为1.2916％的Tyrode’s液、肝素钠溶液20μg/ml、2.0mmol/L咖啡因、牛血清白蛋白6.0mg/ml，余量为水，pH 7.5-7.8；

所述培养液含有如下成分：体积百分数为54％的所述受精液、体积百分数为36％的所述成熟液、体积百分数为10％的胎牛血清，pH 7.2-7.4。