[发明专利]改进的向导RNA

说明书

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及用于基因编辑的改进的向导RNA，以及利用所述改进的向导RNA进行基因编辑的方法和系统。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及用于基因编辑的改进的向导RNA， 以及利用所述改进的向导RNA进行基因编辑的方法和系统。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)-相关(Cas)系统是各种细菌和古细菌中的适应性 免疫系统(Barrangou等，2007；Terns and Terns，2011)。最常用的化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)II型CRISPR-Cas9系统，由Cas9核酸酶和两个短的RNA(CRISPRRNA(crRNA) 和反式激活的CRISPR RNA(tracrRNA))组成。tracrRNA和crRNA可以通过任意的茎环 连接形成单向导RNA(sgRNA)，其长度大约100个核苷酸(Jinek等，2012)。在sgRNA的指导下，由Cas9蛋白和sgRNA组成的复合物可以在特定的基因组基因座产生DNA双 链断裂(DSB)。CRISPR-Cas9系统已被应用于编辑多种生物的基因组(Cong等，2013；Gratz 等，2013；Hwang等，2013；Jiang等，2013；Mali等，2013；Wang等，2013)。除了可以 将表达Cas9蛋白和sgRNA的质粒常规转染到各种细胞系中以进行基因编辑(Cong等， 2013；Ran等，2013；Mali等，2013)，还可直接递送由Cas9蛋白和sgRNA组成的核糖核 蛋白(RNP)(Cas9-sgRNARNP)，其显示出更高的效率和更低的脱靶效应(Kim等，2014； Sung等，2014；Zuris等，2015)，特别是在人原代细胞如T细胞(Hendel等，2015；Schumann 等，2015；Hultquist等，2016)。

CRISPR-Cas9介导的基因编辑对进一步改善细胞疗法具有很大的潜力，并且人原代 细胞(如人CD34⁺造血干细胞和祖细胞(HSPC)和T细胞)的基因编辑对于研究这些细胞类型中的基因功能很重要。CRISPR-Cas9介导的HSPC中BCL11A和HBB基因的编辑对于 治疗β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症显示出很大的希望(Canver等，2015；Dever等， 2016)。CRISPR-Cas9介导的T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞的基因编辑已经在许多 研究中被评估(Schumann等，2015；Mandal等，2014；Poirot等，2015；Liu等，2016；Ren 等，2017；Ren等，2017；Zhang等，2017)。

然而，之前的研究表明使用CRISPR-Cas9RNP进行的多基因编辑阻碍了CAR-T细 胞的增殖(Liu等，2016)。也有报道说Cas9/hCD45sg1RNP处理的人HSPC与Cas9蛋白 处理的对照相比具有较低的细胞数目(Gundry等，2016)。因此，由于CRISPR-Cas9基因 编辑对人原代细胞和CAR-T细胞潜在的负面影响，建立一种简单的方法以消除这些不 利影响是必要的。

此外，为了提高CRISPR基因编辑系统的性能，已经探索了对sgRNA的各种修饰。 化学修饰(如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)或2'-O-甲基3'thioPACE(MSP))已显示增强siRNA的稳定性(Deleavey和Damha，2012；Eckstein，2014)，其也被应用于sgRNA以 及crRNA和tracRNA(Hendel等，2015；Rahdar等，2015)，并提高了基因编辑效率。然 而，用这些修饰合成长RNA寡核苷酸是具有挑战性且昂贵的。由于目前RNA合成技术 的长度限制，难以产生具有额外RNA序列或结构如SAM结构的sgRNA。因此，进一 步建立一种简单且经济的方法以提高sgRNA的稳定性，从而提高CRISPR基因编辑系 统的效率是必要的。

本发明通过提供改进的用于基因编辑的向导RNA特别是单向导RNA，克服了上述问题。

发明概述