[发明专利]改进的向导RNA

权利要求书

1.一种分离的向导RNA(gRNA)，其中所述gRNA：

1)包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构；或

2)通过体外转录产生，且所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团被去除。

2.权利要求1分离的gRNA，其中相对于不包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA，所述包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA在细胞中具有更长的半衰期。

3.权利要求1分离的gRNA，其中相对于具有5’末端磷酸基团的gRNA，所述5’末端磷酸基团被去除的gRNA具有降低的细胞毒性。

4.权利要求1分离的gRNA，其中所述gRNA是sgRNA。

5.一种产生gRNA例如sgRNA的方法，所述方法包括：

步骤a)，通过体外转录或化学合成产生gRNA；和

步骤b)，其包括b1)给所述gRNA添加5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构，或b2)去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

6.权利要求5的方法，其中步骤b2)中通过磷酸酶处理去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

7.权利要求6的方法，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶，例如细菌碱性磷酸酶(BAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)。

8.一种用于修饰细胞基因组中至少一个靶序列的基因编辑系统，其包含：

1)CRISPR效应蛋白，或包含编码CRISPR效应蛋白的核苷酸序列的表达构建体；和

2)权利要求1-4中任一项的gRNA或通过权利要求5-7中任一项的方法产生的gRNA，其中所述gRNA设计为靶向所述靶序列。

9.一种产生经修饰的细胞的方法，所述细胞基因组中至少一个靶序列被修饰，所述方法包括将权利要求8的基因编辑系统导入所述细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞是人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫、鸡、鸭、或鹅的细胞。

11.权利要求9的方法，其中所述细胞是人原代细胞，例如胚胎干细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、T细胞。

12.权利要求9的方法，其中所述细胞是TCR-T细胞或CAR-T细胞，例如包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的TCR-T细胞或CAR-T细胞。

13.权利要求9的方法，其中通过选自磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射的方法将所述基因编辑系统导入所述细胞。

14.一种经修饰的细胞，其由权利要求9-13任一项的方法产生。

15.一种治疗有需要的对象中的疾病的方法，包括向所述对象递送有效量的权利要求8的基因编辑系统以修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

16.权利要求8的基因编辑系统在制备用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物中的用途，其中所述基因组编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

17.一种用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含权利要求8的基因编辑系统和药学可接受的载体，其中所述基因编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

18.权利要求15-17的方法、用途或药物组合物，其中所述对象是哺乳动物，例如人。